核酸的結(jié)構(gòu)與功能(編輯修改稿)
2025-08-28 15:03 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 r = RTs D(1??) Svedberg方程 : d? /dt ?2 ? s = UV吸收 核酸分子中含有嘌呤堿和嘧啶堿，因而具有紫外吸收的的性質(zhì)。在 260nm處核酸紫外吸收最強。核酸的紫外吸收是核酸定量測定的基礎(chǔ)。 1)鑒定純度 純 DNA的 A260/A280應(yīng)為 （ ），若大于 ，表示污染了 RNA。 純 RNA的 A260/A280應(yīng)為 。 若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則 A260/A280比值明顯降低。 2)含量計算 (p195) 天然 DNA 變性 DNA 核苷酸總吸收值 1 2 3 220 240 260 280 波長（ nm） 光吸收 1 2 3 3)、 增色效應(yīng)與減色效應(yīng) 增色效應(yīng)：在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大 減色效應(yīng)：在 DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。 DNA的紫外吸收光譜 二、 DNA的變性 ? 在理化因素作用下 ， DNA雙螺旋的兩條互補鏈松散而分開成為單鏈 ， 從而導(dǎo)致 DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變 ， 這種現(xiàn)象稱為 DNA的變性 。 ? 引起 DNA變性的因素主要有： ① 高溫 ，② 強酸強堿 ， ③ 有機溶劑等 。 DNA的變性過程 加熱 部分雙螺旋解開 無規(guī)則線團 鏈內(nèi)堿基配對 變性過程：當 DNA的稀鹽溶液加熱到 80100℃ 時，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無規(guī)線團。鏈內(nèi)堿基配對 ? DNA變性后的性質(zhì)改變： ① 增色效應(yīng) ：指 DNA變性后對 260nm紫外光的光吸收度增加的現(xiàn)象； ②旋光性下降； ③粘度降低； ④生物學(xué)功能喪失或改變。 ? RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒有 DNA那樣明顯。 ? 利用紫外吸收的變化，可以檢測核酸變性的情況 。例如，天然狀態(tài)的 DNA在完全變性后，紫外吸收 (260 nm） )值增加 25－ 40%，而 RNA變性后，約增加 %。 ? DNA的變性發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中 A260達到最大值一半時的溫度稱為該 DNA的 熔解溫度，用 Tm表示。 Tm的大小與DNA分子中（G+C）的百分含量成正比測定Tm值可推算核酸堿基組成及判斷DNA純度。 影響 Tm的因素 1） G+C的含量越高 ， 則 Tm越高 。 GC%=（ ） 2） DNA均一性：均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍內(nèi)。 3）介質(zhì)中離子強度：其它條件不變，離子強度高， Tm高。 三、 DNA的復(fù)性與分子雜交 ?將熱變性后的 DNA溶液緩慢冷卻 ， 在低于變性溫度約 25～ 30℃ 的條件下保溫一段時間 （ 退火 ） ， 則變性的兩條單鏈 DNA可以重新互補而形成原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原有的性質(zhì) 。 ?將變性 DNA經(jīng)退火處理 ， 使其重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程 ， 稱為 DNA的復(fù)性 。 DNA的復(fù)性不僅受溫度影響，還受 DNA自身特性等其它因素的影響： A、溫度和時間 ：一般認為比 Tm低 25℃ 左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠離此溫度，復(fù)性速度就越慢。復(fù)性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過 Tm的溫度下迅速冷卻至低溫 (如 4℃ 以下 )，復(fù)性幾乎是不可能的，核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性 (單鏈 )狀態(tài)。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利于復(fù)性。 B、 DNA濃度： 溶液中 DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合的機會越大，有利于復(fù)性。 ? 兩條來源不同的單鏈核酸 （ DNA或RNA） ， 只要它們有大致相同的互補堿基順序 ， 經(jīng)退火處理即可復(fù)性 ， 形成新的雜種雙螺旋 ， 這一現(xiàn)象稱為 核酸的分子雜交 。 ? 核酸雜交可以是 DNADNA， 也可以是DNARNA雜交 。 ? 不同來源的 ， 具有大致相同互補堿基順序的核酸片段稱為 同源順序 。 ? 利用核酸的分子雜交 ， 可以確定或?qū)ふ也煌锓N中具有同源順序的 DNA或 RNA片段 。 ? 常用的核酸分子雜交技術(shù)有： 原位雜交 、斑點雜交 、 Southern雜交及 Northern雜交 等 。 ?在核酸雜交分析過程中 ， 常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進行標記 。 這種帶有一定標記的已知順序的核酸片段稱為 探針 。 。 核酸 的變性、復(fù)性和雜交 變性 （加熱） 探針 雜交 （緩慢冷卻） 復(fù)性 （緩慢冷卻） 復(fù)性 ：在 一 定 條件下 ， 變性 DNA 單鏈 間 堿 基重 新 配 對恢 復(fù) 雙 螺旋 結(jié) 構(gòu) ，伴有 A260減小 （ 減色效應(yīng) ）,DNA 的功能恢復(fù) 。 分子雜交的方法 基本步驟 ? ①先將兩種生物的 DNA分子從細胞中提取出來 , ? ② 通過加熱或提高 pH的方法 ,將雙鏈 DNA分子分離成為單鏈 ,這個過程稱為變性。 ? ③將兩種生物的 DNA單鏈放在一起雜交 ,其中一種生物的 DNA單鏈事先用同位素進行標記（探針）。如果兩種生物 DNA分子之間存在互補的部分 ,就能形成雙鏈區(qū)。 ? ④檢測：由于同位素被檢出的靈敏度高 ,即使兩種生物 DNA分子之間形成百萬分之一的雙鏈區(qū) ,也能夠被檢出。 ? 主要方法：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、 Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。 實例： southern印跡 法 （ 顯著特點是硝酸纖維素濾膜能與單股 DNA強力結(jié)合 ） ① 將 DNA標本用 限制性內(nèi)切酶 消化 ， ② 經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳 分離各酶解片段 ， ③ 然后經(jīng) 堿變性 ， Tris緩沖液中和 ， 高鹽下通過毛吸作用將 DNA從凝膠中 轉(zhuǎn)印 至硝酸纖維素濾膜上 ④ 將硝酸纖維素濾膜 烘干 固定 。 凝膠中 DNA片段的相對位置在轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中保持不變 ⑤ 附著在濾膜上的 DNA與 32P標記的探針雜交 ⑥ 利用 放射自顯影術(shù) 確定探針互補的每條 DNA帶的位置 ， 從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一 特定序列的 DNA片段的位置和大小 。 Southern印跡法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 與放射性標記DNA探針雜交 放射自顯影 帶有 DNA片段的凝膠 凝膠 濾膜 用緩沖液轉(zhuǎn)移 DNA 吸附有 DNA片
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