【文章內(nèi)容簡介】 激為主多因素造模法制備經(jīng)前期綜合征（重度，PMDD）肝氣逆證大鼠模型。動物模型評價：采集模型動物證候表征進行證候歸屬評價，檢測模型動物生物指標進行疾病歸屬評價。② 動物模型相關腦區(qū)定位及定位下的神經(jīng)機制 進行相應腦區(qū)定位并應用腦微透析灌流技術，實時檢測去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5HT）等關鍵指標水平變化。③動物模型外周血及不同腦區(qū)關鍵指標變化特點與關鍵基因功能驗證 檢測模型動物相關腦區(qū)、外周血中關鍵生物指標含量，篩選出與經(jīng)前期綜合征（重度，PMDD）肝氣逆證密切相關的神經(jīng)遞質(zhì)和激素。進行模型動物的基因表達譜分析及關鍵基因的分布、定位及功能驗證，篩選其發(fā)病及藥物干預密切相關靶基因。④相關指標的分子機制及其信號轉導 取正常大鼠相應部位神經(jīng)元進行體外培養(yǎng)，用上述病證的人或動物血清、腦脊液處理細胞，免疫熒光和Western Blot尋找病證相關神經(jīng)遞質(zhì)或激素的受體及其介導的細胞內(nèi)信號轉導。腸易激、高血壓、肝硬化三種疾病病證臨床流行病學橫斷面調(diào)查 通過對三種疾病現(xiàn)代文獻分析，提取與肝藏血主疏泄相關的癥狀、證候要素、證候；依據(jù)此信息建立臨床信息采集量表，通過預調(diào)查進行量表的聯(lián)合信度檢測。 應用臨床信息采集表，在全國多中心同步開展大樣本約800例/病的臨床流行病學橫斷面普查。分別對符合現(xiàn)代疾病診斷和各項納入標準的患者進行臨床軀體癥狀、情緒精神癥狀的調(diào)查，并采用統(tǒng)一的檢測標準，檢測相關實驗室指標。其中主要指標包括：三種疾病同性指標——血液流變學指標、血脂、血糖、血清促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）；血清皮質(zhì)醇，血漿去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5HT）等；各種疾病特有指標。 建立臨床信息數(shù)據(jù)庫，進行多種統(tǒng)計分析，主要包括：頻數(shù)分析描述調(diào)查人群特征；方差分析方法統(tǒng)計不同疾病不同分期的差異性；相關分析方法統(tǒng)計宏觀癥狀與微觀指標的相關性；Logist回歸分析、判別分析提取特征癥狀、指標；并結合無監(jiān)督數(shù)據(jù)分析方法（如基于熵的分析、隱結構模型）確立肝藏血主疏泄功能異常的主要宏觀表現(xiàn)及微觀指標，及其在三種疾病中的共性表現(xiàn)特點和個性特征；建立宏觀與微觀相結合的肝藏血主疏泄功能異常狀態(tài)的判別模式。應用養(yǎng)血調(diào)肝系列方劑對三種疾病患者進行藥物干預，及較為公認的中醫(yī)證候診斷標準，選擇腸易激綜合征肝郁脾虛證300例、脾胃虛寒證100例；高血壓病肝陽上亢證300例、肝火熾盛證100例；肝硬化脾腎陽虛、肝氣滯血瘀證100例、肝腎陰虛、氣滯血瘀證200例。按照臨床為理論創(chuàng)新服務，為實驗研究奠定基礎的原則，按照1：1：1：1的比例，分別設立安慰劑對照組、方證對應組、方證次對應組、非干預證候對照組，參照新藥創(chuàng)制的研究方法，應用養(yǎng)血調(diào)肝方劑的免煎顆粒，進行臨床干預研究。 ，對納入研究的患者分別在治療前、治療后及隨訪期，采集其宏觀臨床癥狀、體征及微觀指標，建立數(shù)據(jù)庫。 應用方差分析、秩和檢驗、判別分析、因子分析、多維尺度分析等多種統(tǒng)計方法，分析各項癥狀、指標在治療前后的差異性；不同證候類型間的差異性；不同疾病間的異同性等。并綜合分析結果分析從肝論證的干預機制及證治規(guī)律。肝藏血主疏泄現(xiàn)代科學內(nèi)涵的實驗研究 建立公認的疾病動物模型。分別采用慢性應激和嗅球切除法制備抑郁癥大鼠模型，采用孤養(yǎng)加慢性不可預見性應激和新生鼠母子分離復合避水應激法建立腸易激綜合征大鼠模型，采用雙腎一夾法和自發(fā)高血壓大鼠構建高血壓大鼠模型，采用腹腔注射二甲基亞硝胺法和皮下注射四氯化碳法誘導肝纖維化大鼠模型。以上的疾病模型分別按照現(xiàn)行的疾病診斷標準進行嚴格的評價，合格動物納入研究。 進行動態(tài)、全面的信息采集。對上述符合疾病診斷的動物模型，從模型成立的時間點起，擬定動物信息觀察表，進行規(guī)范化的動態(tài)信息采集，以評價其證候屬性。信息采集表的條目主要來自于：1) 動物實驗研究文獻提示的反映疾病的動物宏觀表征 和反映證候屬性的動物宏觀表征 ；2) 臨床證候研究文獻提示的與證候密切相關的理化指標；3) 本項目組的臨床研究提示的與具有診斷和鑒別診斷意義的臨床癥狀和可用于證候判別的理化指標特征模式。 動物證候屬性的辨識。 動物證候屬性的辨識以臨床診斷標準為依據(jù)，采用課題組前期建立的以宏觀特征組合、微觀指標特征組合、方劑反證相結合的三維動物證候判別方法進行辨識。首先通過宏觀特征組合和微觀指標特征組合確定各疾病模型的證候演變規(guī)律。通過不同疾病造模方法的比較，篩選出較優(yōu)的抑郁癥肝氣郁結證、腸易激綜合征肝郁脾虛證、高血壓肝陽上亢證、肝硬化肝腎陰虛氣滯血瘀等病證結合動物模型。在上述病證結合動物模型證候屬性穩(wěn)定的時間窗內(nèi)，分別采用對證的養(yǎng)血調(diào)肝方藥和次對證的方藥進行干預治療，并以模型組和正常組作為對照，進一步佐證模型動物的證候屬性。各模型的干預藥物和臨床組統(tǒng)一，以相互應證。 肝藏血主疏泄的調(diào)控機制研究。通過上述篩選得到的穩(wěn)定的反映肝藏血主疏泄異常狀態(tài)的病證結合動物模型作為實驗組，以不符合相應證候診斷的疾病模型和正常組作為對照，從整體、器官、分子三個層面分析肝藏血主疏泄的調(diào)控機制，觀測指標分為共性的核心指標和反映疾病個性的二級指標以及探索性的基因分析指標等三大類。采用HPLC－電化學檢測、ELISA、免疫組化、RTPCR等，研究： （1）核心指標圍繞慢性應激相關的調(diào)控網(wǎng)絡，包括：1）整體指標：行為學實驗、腦血流圖、肝血流圖、功能核磁共振。2）血液指標：神經(jīng)遞質(zhì)（包括DA、NA、NE、5HT、Ach等）；內(nèi)分泌激素（包括CRH、ACTH、皮質(zhì)醇、褪黑素等）；血管舒縮因子（包括ET、CGRP、 AngII 等）、肝臟合成（代謝）的生物活性分子（如 HSP70、Hcy 等）。3）組織檢測指標：神經(jīng)遞質(zhì)、激素及其受體在特定腦區(qū)、疾病相關的效應器官的表達水平（包括DA、NA、5HT 、皮質(zhì)醇等及其受體）和病理形態(tài)學檢測。（2）疾病相關的二級指標1）抑郁癥：氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)含量/受體表達（Glu－NMDA受體、GABA－GABA受體），離子通道和信號轉導分子分析、對信號轉導分子調(diào)節(jié)物質(zhì)（包括PDE4等），適應性調(diào)控分子（包括GRK、βarrestin等）2）腸易激綜合征：在體結腸運動、離體結