【文章內(nèi)容簡介】 激為主多因素造模法制備經(jīng)前期綜合征（重度，PMDD）肝氣逆證大鼠模型。動物模型評價：采集模型動物證候表征進(jìn)行證候歸屬評價，檢測模型動物生物指標(biāo)進(jìn)行疾病歸屬評價。② 動物模型相關(guān)腦區(qū)定位及定位下的神經(jīng)機(jī)制 進(jìn)行相應(yīng)腦區(qū)定位并應(yīng)用腦微透析灌流技術(shù)，實(shí)時檢測去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5HT）等關(guān)鍵指標(biāo)水平變化。③動物模型外周血及不同腦區(qū)關(guān)鍵指標(biāo)變化特點(diǎn)與關(guān)鍵基因功能驗(yàn)證 檢測模型動物相關(guān)腦區(qū)、外周血中關(guān)鍵生物指標(biāo)含量，篩選出與經(jīng)前期綜合征（重度，PMDD）肝氣逆證密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)和激素。進(jìn)行模型動物的基因表達(dá)譜分析及關(guān)鍵基因的分布、定位及功能驗(yàn)證，篩選其發(fā)病及藥物干預(yù)密切相關(guān)靶基因。④相關(guān)指標(biāo)的分子機(jī)制及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 取正常大鼠相應(yīng)部位神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)，用上述病證的人或動物血清、腦脊液處理細(xì)胞，免疫熒光和Western Blot尋找病證相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)或激素的受體及其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。腸易激、高血壓、肝硬化三種疾病病證臨床流行病學(xué)橫斷面調(diào)查 通過對三種疾病現(xiàn)代文獻(xiàn)分析，提取與肝藏血主疏泄相關(guān)的癥狀、證候要素、證候；依據(jù)此信息建立臨床信息采集量表，通過預(yù)調(diào)查進(jìn)行量表的聯(lián)合信度檢測。 應(yīng)用臨床信息采集表，在全國多中心同步開展大樣本約800例/病的臨床流行病學(xué)橫斷面普查。分別對符合現(xiàn)代疾病診斷和各項(xiàng)納入標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行臨床軀體癥狀、情緒精神癥狀的調(diào)查，并采用統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)，檢測相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。其中主要指標(biāo)包括：三種疾病同性指標(biāo)——血液流變學(xué)指標(biāo)、血脂、血糖、血清促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）；血清皮質(zhì)醇，血漿去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5HT）等；各種疾病特有指標(biāo)。 建立臨床信息數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行多種統(tǒng)計(jì)分析，主要包括：頻數(shù)分析描述調(diào)查人群特征；方差分析方法統(tǒng)計(jì)不同疾病不同分期的差異性；相關(guān)分析方法統(tǒng)計(jì)宏觀癥狀與微觀指標(biāo)的相關(guān)性；Logist回歸分析、判別分析提取特征癥狀、指標(biāo)；并結(jié)合無監(jiān)督數(shù)據(jù)分析方法（如基于熵的分析、隱結(jié)構(gòu)模型）確立肝藏血主疏泄功能異常的主要宏觀表現(xiàn)及微觀指標(biāo)，及其在三種疾病中的共性表現(xiàn)特點(diǎn)和個性特征；建立宏觀與微觀相結(jié)合的肝藏血主疏泄功能異常狀態(tài)的判別模式。應(yīng)用養(yǎng)血調(diào)肝系列方劑對三種疾病患者進(jìn)行藥物干預(yù)，及較為公認(rèn)的中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇腸易激綜合征肝郁脾虛證300例、脾胃虛寒證100例；高血壓病肝陽上亢證300例、肝火熾盛證100例；肝硬化脾腎陽虛、肝氣滯血瘀證100例、肝腎陰虛、氣滯血瘀證200例。按照臨床為理論創(chuàng)新服務(wù)，為實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)的原則，按照1：1：1：1的比例，分別設(shè)立安慰劑對照組、方證對應(yīng)組、方證次對應(yīng)組、非干預(yù)證候?qū)φ战M，參照新藥創(chuàng)制的研究方法，應(yīng)用養(yǎng)血調(diào)肝方劑的免煎顆粒，進(jìn)行臨床干預(yù)研究。 ，對納入研究的患者分別在治療前、治療后及隨訪期，采集其宏觀臨床癥狀、體征及微觀指標(biāo)，建立數(shù)據(jù)庫。 應(yīng)用方差分析、秩和檢驗(yàn)、判別分析、因子分析、多維尺度分析等多種統(tǒng)計(jì)方法，分析各項(xiàng)癥狀、指標(biāo)在治療前后的差異性；不同證候類型間的差異性；不同疾病間的異同性等。并綜合分析結(jié)果分析從肝論證的干預(yù)機(jī)制及證治規(guī)律。肝藏血主疏泄現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵的實(shí)驗(yàn)研究 建立公認(rèn)的疾病動物模型。分別采用慢性應(yīng)激和嗅球切除法制備抑郁癥大鼠模型，采用孤養(yǎng)加慢性不可預(yù)見性應(yīng)激和新生鼠母子分離復(fù)合避水應(yīng)激法建立腸易激綜合征大鼠模型，采用雙腎一夾法和自發(fā)高血壓大鼠構(gòu)建高血壓大鼠模型，采用腹腔注射二甲基亞硝胺法和皮下注射四氯化碳法誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型。以上的疾病模型分別按照現(xiàn)行的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行嚴(yán)格的評價，合格動物納入研究。 進(jìn)行動態(tài)、全面的信息采集。對上述符合疾病診斷的動物模型，從模型成立的時間點(diǎn)起，擬定動物信息觀察表，進(jìn)行規(guī)范化的動態(tài)信息采集，以評價其證候?qū)傩?。信息采集表的條目主要來自于：1) 動物實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)提示的反映疾病的動物宏觀表征 和反映證候?qū)傩缘膭游锖暧^表征 ；2) 臨床證候研究文獻(xiàn)提示的與證候密切相關(guān)的理化指標(biāo)；3) 本項(xiàng)目組的臨床研究提示的與具有診斷和鑒別診斷意義的臨床癥狀和可用于證候判別的理化指標(biāo)特征模式。 動物證候?qū)傩缘谋孀R。 動物證候?qū)傩缘谋孀R以臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，采用課題組前期建立的以宏觀特征組合、微觀指標(biāo)特征組合、方劑反證相結(jié)合的三維動物證候判別方法進(jìn)行辨識。首先通過宏觀特征組合和微觀指標(biāo)特征組合確定各疾病模型的證候演變規(guī)律。通過不同疾病造模方法的比較，篩選出較優(yōu)的抑郁癥肝氣郁結(jié)證、腸易激綜合征肝郁脾虛證、高血壓肝陽上亢證、肝硬化肝腎陰虛氣滯血瘀等病證結(jié)合動物模型。在上述病證結(jié)合動物模型證候?qū)傩苑€(wěn)定的時間窗內(nèi)，分別采用對證的養(yǎng)血調(diào)肝方藥和次對證的方藥進(jìn)行干預(yù)治療，并以模型組和正常組作為對照，進(jìn)一步佐證模型動物的證候?qū)傩?。各模型的干預(yù)藥物和臨床組統(tǒng)一，以相互應(yīng)證。 肝藏血主疏泄的調(diào)控機(jī)制研究。通過上述篩選得到的穩(wěn)定的反映肝藏血主疏泄異常狀態(tài)的病證結(jié)合動物模型作為實(shí)驗(yàn)組，以不符合相應(yīng)證候診斷的疾病模型和正常組作為對照，從整體、器官、分子三個層面分析肝藏血主疏泄的調(diào)控機(jī)制，觀測指標(biāo)分為共性的核心指標(biāo)和反映疾病個性的二級指標(biāo)以及探索性的基因分析指標(biāo)等三大類。采用HPLC－電化學(xué)檢測、ELISA、免疫組化、RTPCR等，研究： （1）核心指標(biāo)圍繞慢性應(yīng)激相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括：1）整體指標(biāo)：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、腦血流圖、肝血流圖、功能核磁共振。2）血液指標(biāo)：神經(jīng)遞質(zhì)（包括DA、NA、NE、5HT、Ach等）；內(nèi)分泌激素（包括CRH、ACTH、皮質(zhì)醇、褪黑素等）；血管舒縮因子（包括ET、CGRP、 AngII 等）、肝臟合成（代謝）的生物活性分子（如 HSP70、Hcy 等）。3）組織檢測指標(biāo)：神經(jīng)遞質(zhì)、激素及其受體在特定腦區(qū)、疾病相關(guān)的效應(yīng)器官的表達(dá)水平（包括DA、NA、5HT 、皮質(zhì)醇等及其受體）和病理形態(tài)學(xué)檢測。（2）疾病相關(guān)的二級指標(biāo)1）抑郁癥：氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)含量/受體表達(dá)（Glu－NMDA受體、GABA－GABA受體），離子通道和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子分析、對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子調(diào)節(jié)物質(zhì)（包括PDE4等），適應(yīng)性調(diào)控分子（包括GRK、βarrestin等）2）腸易激綜合征：在體結(jié)腸運(yùn)動、離體結(jié)