【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 0mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨水溶液混合。 革蘭氏碘液碘 1g碘化鉀 2g蒸餾水 300mL將碘與碘化鉀混合，加入蒸餾水少許，充分搖勻，待完全溶解，再加入蒸餾水至300mL。 脫色液95％乙醇。 沙黃復(fù)染液沙黃 1g95％乙醇 2g蒸餾水 90mL將沙黃溶于 95％乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。 染色法染色的基本步驟為：1）涂片：在載玻片上滴加一滴生理鹽水，用滅菌的接種環(huán)取菌落少許，與生理鹽水混勻，涂布成薄膜；2）干燥：在室溫中使自然干燥；3）固定：將涂片迅速通過火焰 2～3 次，以載玻片反面接觸皮膚，熱而不燙為度；4）染色：滴加結(jié)晶紫染色液，染色 1min，水洗；5）媒染：滴加革蘭氏碘液，作用 1min，水洗；6）脫色：滴加10 / 2895％乙醇脫色，約 30s，水洗；7）復(fù)染：滴加復(fù)染液，復(fù)染 1min，水洗。革蘭氏陽性菌染色后呈紫色，革蘭氏陰性菌染色后呈紅色。注：亦可用 1：10 稀釋的石炭酸復(fù)紅染色液作復(fù)染劑，復(fù)染時(shí)間為 10s。A3 檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)程序見圖 A.A4 操作步驟 樣品準(zhǔn)備 污水污水樣品應(yīng)至少取 200mL，使用前應(yīng)充分混勻。根據(jù)預(yù)計(jì)的污水樣品中糞大腸菌群數(shù)確定污水樣品接種量。糞大腸菌群數(shù)量相對(duì)較少的接種量一般為 10mL、1mL、。糞大腸菌群數(shù)較多時(shí)接種量為 1mL、或 、 等。接種量少于 1mL 時(shí)，水樣應(yīng)制成稀釋樣品后供發(fā)酵試驗(yàn)使用。接種量為、 時(shí)，取稀釋比分別為 1:1:100。其它接種量的稀釋比依此類推。1:10 稀釋樣品的制作方法為：吸取 1mL 水樣，注入到盛有 9mL 滅菌水的試管中，混勻，制成 1:10 稀釋樣品。因此，取 1mL1:10 稀釋樣品，等于取 污水樣品。其它稀釋比的稀釋樣品同法制作。注 1：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污水，應(yīng)在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 污泥 鑒 定 ： 挑 取 革 蘭 氏 陰 性 無 芽 孢 桿 菌 接 種 于 乳 糖 蛋 白 胨 培 養(yǎng) 液 4℃ 、 培 養(yǎng) 24h 4℃ 、 培 養(yǎng) 24h 37℃ 、 培 養(yǎng) 18～ 24h 圖 A 污 水 、 污 泥 中 糞 大 腸 菌 群 檢 驗(yàn) 程 序 樣 品 處 理 ： 確 定 樣 品 接 種 量 鑒 定 ： 挑 取 可 疑 菌 落 革 蘭 氏 染 色 、 鏡 檢 計(jì) 數(shù) ： 根 據(jù) 產(chǎn) 酸 產(chǎn) 氣 的 陽 性 管 數(shù) 查 MPN表 平 板 分 離 ： 將 產(chǎn) 酸 發(fā) 酵 管 液 接 種 于 EMB 發(fā) 酵 試 驗(yàn) ： 將 樣 品 接 種 于 乳 糖 膽 鹽 培 養(yǎng) 液 檢 驗(yàn) 結(jié) 果 報(bào) 告 11 / 28污泥樣品應(yīng)至少取 200g，使用前應(yīng)充分混勻。根據(jù)預(yù)計(jì)的污泥樣品中糞大腸菌群數(shù)量確定污泥樣品接種量。糞大腸菌群數(shù)量相對(duì)較少的污泥樣品接種量一般為 、。糞大腸菌群數(shù)量較多時(shí)接種量為、 或 、 等。污泥樣品應(yīng)制成稀釋樣品后供發(fā)酵試驗(yàn)使用。接種量 、 的稀釋樣品制作方法如下：取 20g 污泥樣品，加入到三角燒瓶中，加滅菌水使成 200mL，混勻，制成 1:10 稀釋樣品。吸取 1:10 稀釋樣品 1mL，注入到盛有 9mL 滅菌水的試管中，混勻，制成 1:100 稀釋樣品。按同法制成 1:1000 稀釋樣品。接種 1mL1:1:100、1:1000 稀釋樣品等于接種 、 污泥樣品。注 1：若樣品為經(jīng)過氯消毒的污泥，應(yīng)在采樣后立即用 5％硫代硫酸鈉溶液充分中和余氯。 發(fā)酵試驗(yàn)將樣品接種于裝有乳糖膽鹽培養(yǎng)液的試管（內(nèi)有小倒管）中，44℃培養(yǎng) 24h。樣品接種體積以及管內(nèi)乳糖膽鹽培養(yǎng)液的濃度與體積根據(jù)以下條件確定：樣品為污水時(shí)，取三個(gè)接種量、每個(gè)接種量的樣品分別接種于 5 個(gè)試管內(nèi)，共需 15個(gè)試管。試管內(nèi)乳糖膽鹽培養(yǎng)液的濃度與體積應(yīng)根據(jù)接種量確定。若接種量為 10mL，吸取10mL 樣品接種于裝有 5mL 三倍濃度乳糖膽鹽培養(yǎng)液的試管內(nèi)；若接種量為 1mL 時(shí)，吸取1mL 樣品接種于裝有 10mL 普通濃度乳糖膽鹽培養(yǎng)液的試管內(nèi)；若接種量少于 1mL 時(shí)，吸取1mL 稀釋樣品接種于裝有 10mL 普通濃度乳糖膽鹽培養(yǎng)液的試管內(nèi)。樣品為污泥時(shí)，取三個(gè)接種量、每個(gè)接種量的稀釋樣品分別接種于 3 個(gè)試管內(nèi)，共需9 個(gè)試管。9 個(gè)試管中，各裝有 10mL 乳糖膽鹽培養(yǎng)液。各個(gè)試管接種稀釋樣品體積均為1mL。 平板分離大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)培養(yǎng)液變色、產(chǎn)氣時(shí)小倒管內(nèi)出現(xiàn)氣泡。經(jīng) 24h 培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸的試管內(nèi)培養(yǎng)液分別劃線接種于 EMB 培養(yǎng)基上。置于 37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 18～24h。 鑒定挑選可疑糞大腸菌群菌落，進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢?？梢删溆校?）深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；2）紫黑色，不帶或略帶金屑光澤的菌落；3）淡紫紅色，中心色較深的菌落。上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取上述典型菌落 1～3 個(gè)接種于盛有 5mL 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液倒管和倒管的試管內(nèi)，置于 44℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h。產(chǎn)酸產(chǎn)氣試管為糞大腸菌群陽性管。A5 計(jì)數(shù)根據(jù)證實(shí)有糞大腸菌群存在的陽性管數(shù)，查表 A1 或 A2 可得 100mL 污水或 1g 污泥中糞大腸菌群 MPN 值。由于表 A1 和表 A2 是按一定的三個(gè) 10 倍濃度差接種量設(shè)計(jì)的（污水接種量為10mL、1mL 和 ，污泥接種量為 、 和 ） ，當(dāng)采用其他三個(gè) 10 倍濃度差接種量時(shí)，需要修正表內(nèi) MPN 值，具體方法如下：表內(nèi)所列污水（污泥）最大接種量增加 10 倍時(shí)表內(nèi) MPN 值相應(yīng)降低 10 倍；污水（污泥）最大接種量減少 10 倍時(shí)表內(nèi) MPN 值相應(yīng)增加 10 倍。如污水接種量改為 1mL、和 時(shí)，A1 表內(nèi) MPN 值相應(yīng)增加 10 倍。其它的三個(gè) 10 倍濃度差接種量的 MPN 值相應(yīng)類推。由于 A1 表內(nèi) MPN 值的單位為每 100mL 污水樣品中 MPN 值，而污水以 1L 為報(bào)告單位，因此需將查 A1 表得到的 MPN 值乘上 10，換算成 1L 污水樣品中的 MPN 值。12 / 28表 A1 污水中糞大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表（污水樣品接種量為 5 份 10mL 水樣，5 份 1mL 水樣和 5 份 水樣）陽性管數(shù) 陽性管數(shù) 陽性管數(shù)接種100mL水樣接種10mL水樣接種水樣每100mL水樣中MPN接種100mL水樣接種10mL水樣接種水樣每100mL水樣中MPN接種100mL水樣接種10mL水樣接種水樣每100mL水樣中MPN0 0 0 0 2 0 0 5 4 0 0 130 0 1 2 2 0 1 7 4 0 1 170 0 2 4 2 0 2 9 4 0 2 210 0 3 5 2 0 3 12 4 0 3 250 0 4 7 2 0 4 14 4 0 4 300 0 5 9 2 0 5 16 4 0 5 360 1 0 2 2 1 0 7 4 1 0 170 1 1 4 2 1 1 9 4 1 1 210 1 2 6 2 1 2 12 4 1 2 260 1 3 7 2 1 3 14 1 1 3 310 1 4 9 2 1 4 17 4 1 4 360 1 5 11 2 1 5 19 4 1 5 420 2 0 4 2 2 0 9 4 2 0 220 2 1 6 2 2 1 12 4 2 1 260 2 2 7 2 2 2 14 4 2 2 320 2 3 9 2 2 3 17 4 2 3 380 2 4 11 2 2 4 19 4 2 4 440 2 5 13 2 2 5 22 4 2 5 500 3 0 6 2 3 0 12 4 3 0 270 3 1 7 2 3 1 14 4 3 1 330 3 2 9 2 3 2 17 4 3 2 390 3 3 11 2 3 3 20 4 3 3 450 3 4 13 2 3 4 22 4 3 4 520 3 5 15 2 3 5 25 4 3 5 590 4 0 8 2 4 0 15 4 4 0 340 4 1 9 2 4 1 17 4 4 1 400 4 2 11 2 4 2 20 4 4 2 470 4 3 13 2 4 3 23 4 4 3 540 4 4 15 2 4 4 25 4 4 4 620 4 5 17 2 4 5 28 4 4 5 690 5 0 9 2 5 0 17 4 5 0 410 5 1 11 2 5 1 20 4 5 1 480 5 2 13 2 5 2 23 4 5 2 560 5 3 15 2 5 3 26 4 5 3 640 5 4 17 2 5 4 29 4 5 4 720 5 5 19 2 5 5 32 4 5 5 8113 / 28陽性管數(shù) 陽性管數(shù) 陽性管數(shù)接種100mL水樣接種10mL水樣接種水樣每100mL水樣中MPN接種100mL水樣接種10mL水樣接種水樣每100mL水樣中MPN接種100mL水樣接種10mL水樣接種水樣每100mL水樣中MPN1 0 0 2 3 0 0 8 5 0 0 231 0 1 4 3 0 1 11 5 0 1 311 0 2 6 3 0 2 13 5 0 2 431 0 3 8 3 0 3 16 5 0 3 581 0 4 10 3 0 4 20 5 0 4 761 0 5 12 3 0 5 23 5 0 5 951 1 0 4 3 1 0 11 5 1 0 331 1 1 6 3 1 1 14 5 1 1 461 1 2 8 3 1 2 17 5 1 2 631 1 3 10 3 1 3 20 5 1 3 841 1 4 12 3 1 4 23 5 1 4 1101 1 5 14 3 1 5 27 5 1 5 1301 2 0 6 3 2 0 14 5 2 0 491 2 1 8 3 2 1 17 5 2 1 701 2 2 10 3 2 2 20 5 2 2 941 2 3 12 3 2 3 24 5 2 3 1201 2 4 15 3 2 4 27 5 2 4 1501 2 5 17 3 2 5 31 5 2 5 1801 3 0 8 3 3 0 17 5 3 0 791 3 1 10 3 3 1 21 5 3 1 1101 3 2 12 3 3 2 24 5 3 2 1401 3 3 15 3 3 3 28 5 3 3 1801 3 4 17 3 3 4 32 5 3 4 2101 3 5 19 3 3 5 36 5 3 5 2501 4 0 11 3 4 0 21 5 4 0 1301 4 1 13 3 4 1 24 5 4 1 1701 4 2 15 3 4 2 28 5 4 2 2201 4 3 17 3 4 3 32 5 4 3 2801 4 4 19 3 4 4 36 5 4 4 3501 4 5 22 3 4 5 40 5 4 5 4301 5 0 13 3 5 0 25 5 5 0 2401 5 1 15 3 5 1 29 5 5 1 3501 5 2 17 3 5 2 32 5 5 2 5401 5 3 19 3 5 3 37 5 5 3 9201 5 4 22 3 5 4 41 5 5 4 16001 5 5 24 3 5 5 45 5 5 5 160014 / 28表 A2 污泥中糞大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表（污泥樣品接種量為 3 份 泥樣，3 份 泥樣和 3 份 泥樣）