國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-新城疫診斷技術(shù)【整理版】(編輯修改稿)
2025-08-10 19:33 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 h為中等毒力型NDV，MDT大于90 h為 低毒力NDV；b)ICPI越大，NDV致病性越強(qiáng)，最強(qiáng)毒力病毒的ICPI接近2．0，而弱毒株毒力的ICPI為0；c)IVPI越大，NDV致病性越強(qiáng)，最強(qiáng)毒力病毒的IVPI可達(dá)3．0，而弱毒株的IVPI為0。5血凝試驗(yàn)5．1材料與試劑5．1．1 器材：普通天平、分析天平、普通離心機(jī)、微型振蕩器、煮沸消毒器、冰箱、高壓滅菌器、微量移液 器、滴頭、96孔V形血凝反應(yīng)板。5．1．2 pH7．2磷酸鹽緩沖液(PBS)配制方法參見(jiàn)附錄A。5．1．3 1％雞紅細(xì)胞懸液配制方法參見(jiàn)附錄B。5．1．4標(biāo)準(zhǔn)新城疫病毒抗原、購(gòu)入的標(biāo)準(zhǔn)新城疫病毒應(yīng)檢測(cè)其血凝效價(jià)并進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，以檢查與所 標(biāo)HA效價(jià)是否相符。若不符，應(yīng)重復(fù)檢測(cè)并到相關(guān)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。5．2血凝試驗(yàn)操作程序 血凝試驗(yàn)操作程序如下：a) 取96孔v形微量反應(yīng)板，用微量移液器在1孔～12孔每孔加0．025 mL PBS；b)吸取0．025mL病毒懸液加入第1孔中，吹打3次～5次充分混勻；c)從第1孔中吸取0．025 mL混勻后的病毒液加到第2孔，混勻后吸取0．025 mL加入到第3 孔，依次進(jìn)行系列倍比稀釋到第11孔，最后從第11孔吸取0．025 mL棄之，設(shè)第12孔為PBS3GB／T 165502008 對(duì)照；d)每孔再加0．025 mL PBS；e)每孔加入0．025 mL體積分?jǐn)?shù)為1％的雞紅細(xì)胞懸液；f)振蕩混勻反應(yīng)混合液，室溫20℃～25℃下靜置40 min后觀察結(jié)果，若環(huán)境溫度太高，放4℃ 靜置60 rain，PBS對(duì)照孔的紅細(xì)胞成明顯的鈕扣狀沉到孔底時(shí)判定結(jié)果。5，3結(jié)果判定 結(jié)果判定細(xì)則如下： a)在PBS對(duì)照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細(xì)胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀釋度為該抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀釋倍數(shù)為1個(gè)血凝單位(HAU)。b)如果沒(méi)有血凝活性或血凝效價(jià)很低，則采用SPF雞胚用初代分離的尿囊液繼續(xù)傳兩代，若仍 為陰性，則認(rèn)為新城疫病毒分離陰性。c)對(duì)于血凝試驗(yàn)呈陽(yáng)性的樣品應(yīng)采用新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)一步進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。6血凝抑制試驗(yàn)6．1材料與試劑6．1．1器材同5．1．1。6．1．2試劑同5．1．2。6．1．3標(biāo)準(zhǔn)抗NDV血凝抑制抗體(血清)。6．1．4 4個(gè)血凝單位的病毒液制備：根據(jù)4．2測(cè)定的病毒的血凝效價(jià)，判定4個(gè)血凝單位的稀釋倍數(shù)。 方法舉例為：如病毒HA效價(jià)為91092，其4個(gè)血凝單位為71092，則將病毒稀釋128倍即可。6．1．5 HI效價(jià)高于101092時(shí)可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)。6 2 HI試驗(yàn)程序 HI試驗(yàn)操作程序如下： a)根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4個(gè)血凝單位(4HAU)抗原。以能引起100％血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)代表1個(gè)血凝單位，4HAU的配制方法如下：假設(shè)抗原的血凝滴度為1：256，則4HAU抗 原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1：64(256除以4)，稀釋時(shí)，將1 mL抗原加入到63 mL PBS中即為4HAU抗原。b)取96孔V形微量反應(yīng)板，用移液器在第1孔～第11孔各加入0．025 mL PBS，第1z孔加入0．05 mL PBS。c)在第1孔加入o，035 mL新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，充分混勻后移出o．025 mL至第2}L，依次類(lèi) 推，倍比稀釋至第10孔，第10孔棄去0，025 mL，第11孔為陽(yáng)性對(duì)照，第12孔為PBS對(duì)照。d)在第1孔～第11孔各加入0．025 mL含4HAU抗原，輕叩反應(yīng)板，使反應(yīng)物混合均勻，室溫下 (約20℃～25℃)靜置不少于30 min，4℃不少于60 min。e)每孔加入o．025 mL體積分?jǐn)?shù)為1％的紅細(xì)胞懸液，輕晃混勻后，室溫(約20℃～25℃)靜置 約40 min，若環(huán)境溫度太高，放4℃靜置60 min。當(dāng)PBS對(duì)照孔
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