世界上最完善最詳細(xì)的神經(jīng)元原代培養(yǎng)完全黃金版(編輯修改稿)
2025-07-24 07:18 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ）。筆者是配成2mg/ml的木瓜酶。另外要用的是DNA酶。DNA酶的作用是，消化掉破裂細(xì)胞的DNA，避免了釋放的DNA和蛋白纏結(jié)在組織塊表面而阻礙進(jìn)一步消化。DNA酶由于各個公司的活性不一樣，很難有標(biāo)準(zhǔn)濃度，需要摸條件，不過不是很嚴(yán)格，只要能防止DNA纏結(jié)就好。木瓜酶的特點是不會消化過頭，非常溫和。缺點是一定要現(xiàn)配（請直接用無血清的培養(yǎng)液配來保證神經(jīng)元的營養(yǎng)代謝，而且一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。消化的技巧：消化時候，很多人有不良習(xí)慣，喜歡用個50ml試管裝著所有東西。結(jié)果是組織都沉底，下面消化不足，上面消化的沒細(xì)胞。筆者的技巧是，用一個6或10CM 培養(yǎng)皿來消化。這樣消化液在培養(yǎng)皿里形成淺而廣闊的一層，均勻分布著組織塊，從而徹底解決了上述問題。消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+適量DNA酶。木瓜蛋白酶很便宜請放心。消化過程是2030分鐘。由于木瓜蛋白酶溫和，因此不會消化過頭，使得你的實驗消化的很穩(wěn)定。消化時候請在37度溫箱里，每5分鐘稍微搖動一下。注意：1）木瓜酶不要用巰基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率壞很多；2）盡量用不含血清的培養(yǎng)液來配置木瓜酶而不是用hanks，使得神經(jīng)元保持營養(yǎng)；3）木瓜酶一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。再次重申：除了消化過程中要37度，其余任何時刻都是要浸泡在0度（冰?。┑囊后w中。消化過后可以用1ml血清終止反應(yīng)（我是用馬血清，便宜，但是切忌不要用國產(chǎn)血清，污染幾率很大）。把消化用的培養(yǎng)皿放在冰上冷卻，然后墊高一面使得液體集中在另外一面便于吹打。整個體系靜止23分鐘，然后仔細(xì)的去掉上層的液體，保留消化過的組織塊：吹打。筆者經(jīng)驗是，沒有必要用巴斯德管。對于胎鼠和10天之內(nèi)的新生鼠，一般的1ml藍(lán)槍頭就可以達(dá)到滿意的效果。在一邊被墊高的皿里面，吹打10次。吹打時候要注意，切忌過快，要緩慢吹打。吸入時候要很緩慢，吹出的時候可以略快，但是也要緩慢。輕柔吹打是細(xì)胞成活關(guān)鍵！要用進(jìn)口槍頭，國產(chǎn)的有時候會過細(xì)。我們采用的是最合理的分步吹打法。每個10次吹打過后，靜止2分鐘。這時候游離的單細(xì)胞在上面，而團塊會沉到下面去。上面的那層就是你要的單個懸浮細(xì)胞，把它們挪到指定容器里（一樣要冷在冰上）。下面沉淀下去的細(xì)胞團塊不要丟棄，重復(fù)剛才的步驟，輕柔吹打，再靜止2分鐘，轉(zhuǎn)移上層的單細(xì)胞到剛才指定容器里，一共這樣分步吹打3次。3次之后如果還有團塊在下面，請果斷丟棄。造成這個的原因就是剛才的血管膜沒剝好。這個分步吹打的過程保證了每一個單細(xì)胞都避免了過度吹打，而分布吹打又保證了盡可能多的收獲單細(xì)胞。重申一下，為了保證最大程度收獲活細(xì)胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。這招可以更容易收獲大量高質(zhì)量細(xì)胞，尤其是實驗材料不足時候。消化和吹打非常忌諱操作的細(xì)胞過多，這樣反而會使大量細(xì)胞死亡。實驗者如果是用的皮層這種原材料充足的話，切忌不要放入過多皮層。9（可選可不選，但是我建議全選）神經(jīng)元進(jìn)一步純化。 一般來說，收獲的細(xì)胞懸液已經(jīng)是很純的神經(jīng)細(xì)胞了。但是，由于實驗者等個人或者客觀原因，血管膜可能不會被完全剝離；雜細(xì)胞可能也被吹入了細(xì)胞懸液；操作者手法不熟練，造成死細(xì)胞過多，影響種板等等原因，還是會影響到培養(yǎng)的神經(jīng)元的質(zhì)量。為了克服這些，筆者查了一些文獻(xiàn)，經(jīng)過反復(fù)測試采用了nycoprep低轉(zhuǎn)速密度梯度離心。，NycoPrep? 推薦稀釋成 60%，就用剛才懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液來配置。注意：，如果你拿到
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1