【文章內容簡介】 lexa 技術 Illumina 公司的 Genome Analyzer 于 2020 年問世，它是一種基于 Solexa 技術的測序系統(tǒng)。該技術利用邊合成邊測序的方法（ sequencing by synthesis， SBS）， 它的原理是： ① 待測 DNA 文庫的構建 把待測序列打斷成 200500bp 的小片段，并在小片段兩端加上不同的接頭，連接載體，構建 ssDNA 文庫。 ② DNA 與 流動槽（ flow cell） 的附著 將 DNA 片段變成單鏈后通過 接頭與芯片表面的引物堿基互補而使一端固定在芯片上，另外一端 隨機 和附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成橋狀結構 。流動槽是一種含有8 個 chanel 的微纖維板 ，它的表面固定有很多接頭，能支持 DNA 在其表面進行橋式擴增。 ③ Bridge PCR（橋式 PCR） 向反應體系中添加未標記的 核苷酸和酶，進行 bridge PCR 擴增。 Bridge PCR 以流動槽表面的固定接頭為模板，將橋型 ssDNA 擴增為橋型 dsDNA。將橋型 dsDNA 變性為 ssDNA，繼續(xù)擴增。經(jīng)不斷的擴增 變性循環(huán)，每一種 ssDNA 都在各自的位置集中 成束（ cluster），每一束含有單個模板分子的 5001000 個拷貝 ，從而達到能支持下一個測序反應所需信號強度的模板量。 隨后將 DNA 簇線性化。 ④ 測序 測序采用 邊合成邊測序的方法（ SBS） 。向反應體系中同時添加 DNA 聚合酶、接頭引物和帶有 堿基特異熒光標記的 4 種 dNTP（ 可逆終止子 ） 。 由于這些 dNTP 的 3’羥基被化學方法保護，因而每輪合成反應只能添加一個 dNTP，在 dNTP 被添加到合成鏈上之后， 所有未使用的游離 dNTP 和 DNA 聚合酶會被洗脫 。加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用 激光激發(fā)熒光信號，用光學設備完成熒光 信號的記錄，再通過計算機分析轉化為測序結果 。當熒光 信號的記錄完成后，加入化學試劑淬滅熒光信號并去除 dNTP 的 3’羥基保護基團， 以便進行下一輪測序反應。 Solexa 測序技術流程 2020 年， Solexa 推出 對讀測序方法（ pairedend）方法 （或末端配對法） ，即在構建待測DNA 文庫時在兩端的接頭上都加上測序引物結合位點，在第一輪測序完成后 ，去除第一輪測序的模板鏈，用對讀測序模塊（ PairedEnd Module） 引導 互補鏈在原位置再生和擴增，以達到第二輪測序所用的模板量，進行第二輪互補鏈的測序。 優(yōu)缺點。 使用對讀測序方法， Solexa 讀取長度可達 2*75bp，相比 454 后續(xù)序列拼接工作的計算量和難度大大 增加。但由于 Solexa 技術在合成中每次只能添加一個 dNTP，因此很好地解決了同聚物長度的準確測量問題。其主要錯誤來源為核苷酸的替換，而不是插入或缺失。 （ 3） ABI 的 SOLiD 技術 SOLiD 全稱 Supported Oligo Ligation Detetion， ABI 的 SOLiD 測序系統(tǒng) 基于連接酶測序法，即利用 DNA 連接酶在連接過程中進行測序。它的原理是： ① 待測 DNA 文庫的構建 SOLiD 系統(tǒng)支 持兩種測序模板：片段文庫（ fragment library）或配對末端文庫（ matepaired library）。片段文庫就是 把待測序列打斷成很小的片段，并在小片段兩端加上不同的接頭，連接載體，構建 ssDNA 文庫。 該文庫適合轉錄組測序、 RNA 定量、 miRNA 研究、重測序、 3’,5’RACE、甲基化分析及 ChIP 測序等。配對末端文庫是將基因組 DNA 打斷后，與中間接頭連接，環(huán)化，然后用 EcoP15 酶切，使中間接頭兩端各有 27bp 的堿基，最后加上兩端接頭，形成文庫。該文庫適用于全基因組測序、 SNP 分析、結構 重排及拷貝數(shù)分析等。 ② Emulsion PCR 與 454 技術的 Emulsion PCR 類似，將帶接頭的 ssDNA 固定在磁珠表面，進行 PCR 擴增，并對擴增產物進行 3’端修飾。 ③連接酶測序 將 3’端修飾的磁珠沉積于上樣玻片（ Slide） ，進行連接酶測序。在沉積過程中可對磁珠密度進行調整，以達到最大通量。向 體系中加入 DNA 連接酶、通用測序引物 n 和具有3’XXnnnzzz5’結構的的八聚核苷酸 。在 這個八聚核苷酸中，第 1 和第 2 位（ XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在第 68 位（ zzz）上加了不同的熒光標 記 。這種由兩個堿基決定的測序方法被稱為兩堿基測序（ two base encoding）。當八聚核苷酸因第 1 和第 2 位配對而被連接酶連接上時，會發(fā)出熒光。在記錄下熒光信息后，通過化學方法在第 5 和第 6 位之 SOLiD 測序技術流程 間進行切割，淬滅熒光信號，以進行下一個位置的測序。通過這種方法，每次測序的位置都相差五位，即第一次測第 1 和第 2 位，第二次測第 6 和第 7 位??在測到末尾后，將新和成的鏈變性、洗脫。然后用通用引物 n1 進行第二輪測序。 接下來， 分別加入通用測序引物 nn n4 進行測序，這樣可以完成全 部位置的測定，且每個位置均被測定了 2 次。 優(yōu)缺點 。與 Solexa 類似，后續(xù)的序列拼接工作非常復雜。但由于采用兩堿基測序，準確率較高。 第三代測序技術 Helicos 公司的 Heliscope 單分子測序儀、 Pacific Biosciences 公司的 SMRT 技術和 Oxford Nanopore Technologies 公司研究的納米孔單分子測序，被認為是第三代測序技術 。其最大的特點是單分子測序。 其中， Heliscope 技 術和 SMRT 技術利用熒光信號進行測序，而納米孔單分子測序技術利用不同堿基產生的電信號進行測序。 Helicos 公司的 Heliscope 單分子測序儀基于邊合成邊測序的思想 。將待測序列打斷成小片段并在 3’端加上 poly（ A），用末端轉移酶在接頭末端加上 Cy3 熒光標記。用小片段與表面帶有寡聚 Poly（ T）的平板雜交。然后加入 DNA 聚合酶和 Cy5 熒光標記的 dNTP 進行 DNA合成反應，每一輪反應加入一種 dNTP。將未參與合成的 dNTP 和 DNA 聚合酶洗脫，檢測上一步記錄的雜交位置是否有熒光信號，若有，則說明該位置結合了 所加入的這種 dNTP，用化學試劑去掉熒光標記，以便下一輪反應。 經(jīng)過不斷地重復合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。讀取長度約為 3035bp，每循環(huán)數(shù)據(jù)產出量為 2128Gb。 類似 454，在面對同聚物時有一些困難，但并不十分嚴重。同聚物合成導致熒光信號減弱，可據(jù)此推測同聚物長度；另外可通過二次測序來提高準確度。對 Heliscope 來說，主要錯誤來源是缺失，由合成中可能摻有未標記的堿基所致。 斯坦福大學的科學家利用 heliscope 單分子測序儀，用了 48000 美元的試劑和 4 個星期的時間，對一名白人男子的基因組進 行了測序。覆蓋度達 28 倍，覆蓋 90%人類參考基因組，讀長 2470bp，平均讀長 32bp，并鑒定出 280 萬個 SNP 位點和 752 萬個拷貝數(shù)變異。 Pacific Biosciences 的 SMRT 技術 基于邊合成邊測序的思想 ，以 SMRT 芯片為載體進行測序反應。 SMRT 芯片 是一種帶有很多 ZMW（ zeromode waveguides）孔的厚度為 100nm的金屬片。將 DNA 聚合酶、待測序列和不同熒光標記的 dNTP 放入 ZMW 孔的底部 進行合成反應。 與其他技術不同的是，熒光標記的位置是磷酸基團而不是堿基 。當一個 dNTP 被 加入到合成鏈上的同時， 會進入 ZMW 孔的信號檢測區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光種類可判斷 dNTP 種類 。且由于其在檢測區(qū)停留的時間 （ ms） 與進入、離開的時間 （μ s）相比很長，所以信號強度很大。在下一個 dNTP 被添加之前，這個 dNTP 的磷酸集團會被氟聚合物（ fluoropolymer）切割并釋放， 熒光分子離開熒光信號檢測區(qū) 。 SMRT 技術測序速度很快，可達每秒 10 個 dNTP。 SMRT 技術測序流程 Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的 納米孔單分子技術是一種基于電信號測序 的技術 。 他們 設計了一種 以α 溶血素為材料制作的納米孔，在孔內共價結合有分子接頭環(huán)糊精 。用核酸外切酶 切割 ssDNA 時， 被切下來的單個堿基會落入納米孔，并和孔內的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的電流強度，這種電流強度的變化幅度就成為每種堿基的特征 ， 堿基在納米孔內的停留時間是毫秒級的，它的解離速率常數(shù)與電壓有關， 180mV的電壓就能夠保證在電信號記錄后將堿基從納米孔中清除。 另一大特點 是 能夠直接讀取甲基化的胞嘧啶 ， 而不像傳統(tǒng)方法那樣必須要用重亞硫酸鹽（ bisulfite）處理 ，這對于在基因組水平研究表觀遺傳相 關現(xiàn)象提供了巨大的幫助。 該方法準確率高，且發(fā)現(xiàn)錯誤易修正，因為4 種堿基中的 2 種與另外 2 種的電信號差異很明顯。另外，每次只測定一個核苷酸，很容易解決同聚物長度的測量問題。目前面臨的問題是尋找合適的外切酶載體以及承載納米孔平臺的材料。 目前，我國也啟動了第三代測序技術的研究。 2020 年 12 月，中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所 浪潮基因組科學聯(lián)合實驗室”，利用各自的優(yōu)勢聯(lián)合研發(fā)國產第三代測序儀，第一臺樣機預計 2020 年問世，屆時有望緩解測序儀核心技術受制于國外公司的現(xiàn)狀。 測序技術的發(fā)展趨勢 三代測序的比較見下頁表。 測序成本 、 讀取長度 和 測序通量 是評價測序技術先進與否的重要標準。 測序成本在一定