【文章內容簡介】 結構與活性中心產生影響，繼而影響到標記強度與特異性。在很多情況下探針作用的最佳pH值往往與該蛋白作用的最佳pH值有一定差別。例如有一種來自真菌的纖維素酶本來在pH ，但結合到膠體金上后。（2）離子環(huán)境有些蛋白只有在一定離子環(huán)境中才有生物活性，其中很多涉及Ca2+，Mg2+，Mn2+，Cu2+等陽離子。有時溶液中Ca2+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而導致標記失敗；因此，在配制標記溶液時要注意各種陰陽離子的配伍，添加順序及溶液pH。（3）溫度標記溫度對標記活性及特異性影響最大，也最容易出問題。以水解酶類做成的膠體金探針對溫度變化也更為敏感，不同溫度、不同時間標記出的切片其視覺效果完全不一樣。在此特別指出一點，在用內切的水解酶探針時，切忌溫度過低，時間過長，否則會出現(xiàn)標記的擴散現(xiàn)象。建議在可能時盡量使用外切酶探針。在使用IgG或Protein A，Protein G探針時，有人認為在4℃下長時間標記特異性最好。但我們研究發(fā)現(xiàn)事實并非如此，在25℃以上的室溫下標記2060 min其特異性更好。一般來說，如果用來自植物或微生物的蛋白做探針，標記溫度最好在25℃左右；用來自動物的蛋白做探針時，標記溫度最好在30℃左右。（4）封閉液組成封閉液對封閉有關非特異性活性基團，特別是醛基至關重要。在多數(shù)情況下封閉液與探針重懸浮液、標記溶液是一樣的。目前最常用的封閉液組分有BSA、卵清蛋白、脫脂奶粉、PEG20000等。在用IgG、Protein A、Protein G等標記時，應優(yōu)先選用BSA(組分五)；在植物凝集素類探針標記時，應優(yōu)先選用PEG20000。也有人發(fā)現(xiàn)IgG探針標記時脫脂奶粉最佳。如果是用交聯(lián)蛋白做成的探針，那么封閉液中最好有載體蛋白的成分。4．樣品的低溫包埋的基本程序(1) 將新鮮樣品切成113 mm3的小塊，立即放入3%甲醛和1%戊二醛的磷酸緩沖液(100 mM, pH )中4176。C下固定2 h；(2) 在4176。C依次用30%、50%乙醇溶液脫水，每步30 min；(3) 在20176。C冰箱中依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脫水，每步60 min；（注意乙醇溶液首先在冰箱中預冷?。?4) 在20176。C冰箱中依次用30%、70%、100%的K4M滲透，每步120 min；注意不斷輕輕搖動樣品使?jié)B透完全。(5) 在4176。C K4M樹酯包埋。注意包埋劑應盡量裝滿，否則氣泡中的氧氣會抑制包埋劑的聚合。(6) 在20176。C冰箱中長紫外線照射聚合72 h。室溫下聚合48 h。注意每天翻動2次樣品使紫外光照射均勻。(7) 聚合后的樣品應及時切片，長時間放置會導致樣品與包埋劑之間分離而無法切片。(8) 超薄切片應收集在鎳網、金網或鈹網上做膠體金標記。與其它標記用包埋劑相比，K4M可在35176。C低溫下仍保持較低的黏度；K4M有極性，親水，易脫水，易標記；聚合后交聯(lián)度高，易切片。K4M的配方根據材料的性質確定。植物或堅硬的材料包埋劑的硬度要高；動物或幼嫩材料包埋劑的硬度要低。具體參見包埋劑說明。注意：(1) K4M有毒，須帶PVC或PVDV手套謹慎操作。濺入眼睛或皮膚時請立刻用清水沖洗。(2) 所有脫水乙醇須提前預冷。(3) 脫水過程中防止樣品結霜吸潮。5．樣品常溫包埋（常規(guī)）的基本程序（1） 將新鮮樣品切成113 mm3的小塊，立即放入4%戊二醛的磷酸緩沖液(100 mM, pH )中4176。C下固定6－12 h；（2） 樣品用磷酸緩沖液沖洗3次每次5 min；然后在2%鋨酸溶液中固定1 h；沖洗3次，每次5分鐘。（通風櫥中戴手套進行，含鋨酸廢液倒入食用油中?。?） 在4176。C或室溫下依次用30%、50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脫水，每步15 min；（4） 依次用30%、70%、100%的Spurr包埋劑滲透，每步120 min；然后在100%的Spurr包埋劑中過夜。（5） Spurr包埋劑包埋。 ml的離心管中， ml包埋劑即可。加入紙標簽。（6） 在70176。C溫箱中聚合12－16 h。（7） 聚合后的樣品可長時間保存。超薄切片應收集在鎳網、金網或鈹網上做膠體金標記。6．膠體金直接標記基本程序(1) 在培養(yǎng)皿中鋪上石蠟膜(parafilm)；四周加吸水紙和水以保濕；(2) 加一滴dd H2O，鎳網切片向下漂浮2 min；(3) 另滴50 ml封閉液(BL)，將鎳網切片向下漂浮30 min；(4) 另滴50 ml封閉液(BL)，加入23 ml膠體金探針，充分混勻；將鎳網切片向下漂浮30 min；(5) 標記后鎳網的在dd H2O上漂洗除去未標記的膠體金探針，共漂洗3次，每次510 min；晾干；(6) 常規(guī)染色，觀察。7．膠體金間接標記基本程序(1) 鎳網切片向下在dd H2O上漂浮2 min；(2) 在封閉液(BL)上漂浮30 min；(3) 把一抗用BL稀釋100500倍，將鎳網切片向下漂浮3060 min；(4) dd H2O漂洗兩次各5 min，除去多余一抗；(5) 在封閉液(BL)上漂浮30 min；(6) 用膠體金探針標記30 min；(7) dd H2O上漂洗除去未標記的膠體金探針，共漂洗3次，每次510 min；晾干；(8) 常規(guī)染色，觀察。8．利用膠體金間接標記法進行雙標記的基本程序(1) 鎳網切片向下在dd H2O上漂浮2 min；(2) 在封閉液(BL)上漂浮30 min；(3) 把一抗A用BL稀釋100500倍，將鎳網切片向下漂浮3060 min；(4) dd H2O漂洗兩次各5 min，除去多余一抗A；(5) 在封閉液(BL)上漂浮30 min；(6) 用小顆粒膠體金探針A標記30 min；(7) dd H2O漂洗兩次各5 min，除去多余膠體金探針A；(8) 重復步驟(2)(7)，其中抗體和探針改用一抗B和大顆粒膠體金探針B；(9) dd H2O上漂洗除去未標記的膠體金探針，共漂洗3次，每次510 min；晾干；(10) 常規(guī)染色，觀察。9．利用膠體金直接標記法進行雙標記的基本程序如果兩種探針的重懸浮液相同（如同為IgGgold），可直接混合，按上述5的方法進行。單混合時大顆粒膠體金的量要適當增加。如果兩種探針的重懸浮液差別較大，可分別進行直接標記。步驟如下：(1) 鎳網切片向下在dd H2O上漂浮2 min；(2) 在封閉液1上漂浮30 min；(3) 用膠體金探針1標記30 min；(4) dd H2O上漂洗除去未標記的膠體金探針，共漂洗2次，每次510 min；(5) 在封閉液2上漂浮30 min；(6) 用膠體金探針2標記30 min；(7) dd H2O上漂洗除去未標記的膠體金探針，共漂洗3次，每次510 min；晾干；(8) 常規(guī)染色，觀察。10．直接法標記粗提純病毒(1) 取新覆膜鎳網，在用BL稀釋500倍的病毒抗血清上漂浮3 min；(2) 在病毒溶液上吸附10 min；(3) BL封閉30 min；(4) 一抗膠體金探針標記30120 min；(5) 水洗3