【文章內(nèi)容簡介】 000）組成。彼此間由二硫鍵交聯(lián)在一起。]，直接用SDS凝膠電泳分析（見第7章）時(shí)，它的區(qū)帶位于肌紅蛋白（相對分子質(zhì)量為16900）和β乳球蛋白（相對分子質(zhì)量37100）良種蛋白之間，當(dāng)這個(gè)毒素蛋白用β巰基乙醇和碘乙酸處理后，在SDS凝膠電泳中仍得到一條區(qū)帶，但其位置靠近標(biāo)記蛋白細(xì)胞素（相對分子質(zhì)量為13370），進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，該毒素蛋白與FDNB反應(yīng)并酸水解后，釋放出游離的DNPGly和DNPTyr。關(guān)于此蛋白的結(jié)構(gòu)，你能做出什么結(jié)論？[該毒素蛋白由兩條不同的多肽鏈通過鏈間二硫鍵交聯(lián)而成，每條多肽鏈的相對分子質(zhì)量各在13000左右。]。（a）對該分子說出來年各種可能的對稱性。穩(wěn)定締合的是哪種類型的相互作用（同種或異種）？（b）假設(shè)四聚體，如血紅蛋白，是由兩個(gè)相同的單位（每個(gè)單位含α和β兩種鏈）組成的。問它的最高對稱性是什么？[（a）C4和D2，C4是通過異種相互作用締合在一起，D2是通過同種相互作用締合在一起，（b）C2因?yàn)槊總€(gè)αβ二聚體是一個(gè)不對稱的原聚體]。考慮一個(gè)多聚體酶復(fù)合物的合成，此復(fù)合物含6個(gè)相同的二聚體，每個(gè)二聚體由一個(gè)多肽A和一個(gè)B組成，多肽A和B的長度分別為300個(gè)和700個(gè)氨基酸殘基。假設(shè)從氨基酸合成多肽鏈，多肽鏈組成二聚體，再從二聚體聚集成多聚體酶，在這一建造過程中每次操作的錯(cuò)誤頻率為108，假設(shè)氨基酸序列沒有錯(cuò)誤的話，多肽的折疊總是正確的，并假設(shè)在每一裝配階段剔除有缺陷的亞結(jié)構(gòu)效率為100%，試比較在下列情況下有缺陷復(fù)合物的頻率：（1）該復(fù)合物以一條6000個(gè)氨基酸連續(xù)的多肽鏈一步合成，鏈內(nèi)含有6個(gè)多肽A和6個(gè)多肽B。（2）該復(fù)合物分3個(gè)階段形成：第一階段，多肽A和B的合成；第二階段，AB二聚體的形成；第三階段，6個(gè)AB二聚體裝配成復(fù)合物。[（1）有缺陷復(fù)合物的平均頻率是6000108=6105][（2）由于有缺陷的二聚體可被剔除，因此有缺陷復(fù)合物的平均率只是最后階段的操作次數(shù)（5此操作裝配6個(gè)亞基）乘以錯(cuò)誤頻率，即：5108。因此它比一步合成所產(chǎn)生的缺陷頻率約低1000倍。]第六章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提要肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白（Hb）是脊椎動物中的載氧蛋白質(zhì)。肌紅蛋白便于氧在肌肉中轉(zhuǎn)運(yùn)，并作為氧的可逆性貯庫。而血紅蛋白是血液中的氧載體。這些蛋白質(zhì)含有一個(gè)結(jié)合得很緊的血紅素輔基。它是一個(gè)取代的卟啉，在其中央有一個(gè)鐵原子。亞鐵（Fe2+）態(tài)的血紅素能結(jié)合氧，但高鐵（+3）態(tài)的不能結(jié)合氧。紅血素中的鐵原子還能結(jié)合其他小分子如CO、NO等。肌紅蛋白是一個(gè)單一的多肽鏈，含153個(gè)殘基，外形緊湊。Mb內(nèi)部幾乎都是非極性殘基。多肽鏈中約75%是α螺旋，共分八個(gè)螺旋段。一個(gè)亞鐵血紅素即位于疏水的空穴內(nèi)，它可以保護(hù)鐵不被氧化成高鐵。血紅素鐵離子直接與一個(gè)His側(cè)鏈的氮原子結(jié)合。此近側(cè)His（H8）占據(jù)5個(gè)配位位置。第6個(gè)配位位置是O2的結(jié)合部位。在此附近的遠(yuǎn)側(cè)His（E7）降低在氧結(jié)合部位上CO的結(jié)合，并抑制血紅素氧化或高鐵態(tài)。氧與Mb結(jié)合是可逆的。對單體蛋白質(zhì)如Mb來說，被配體（如）O2占據(jù)的結(jié)合部位的分?jǐn)?shù)是配體濃度的雙曲線函數(shù)，如Mb的氧集合曲線。血紅蛋白由4個(gè)亞基（多肽鏈）組成，每個(gè)亞基都有一個(gè)血紅素基。Hb A是成人中主要的血紅蛋白，具有α2β2的亞基結(jié)構(gòu)。四聚體血紅蛋白中出現(xiàn)了單體血紅蛋白所不具有的新性質(zhì)，Hb除運(yùn)載氧外還能轉(zhuǎn)運(yùn)H+和CO2。血紅蛋白以兩種可以相互轉(zhuǎn)化的構(gòu)象態(tài)存在，稱T（緊張）和R（松弛）態(tài)。T態(tài)是通過幾個(gè)鹽橋穩(wěn)定的。無氧結(jié)合時(shí)達(dá)到最穩(wěn)定。氧的結(jié)合促進(jìn)T態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镽態(tài)。氧與血紅蛋白的結(jié)合是別構(gòu)結(jié)合行為的一個(gè)典型例證。T態(tài)和R態(tài)之間的構(gòu)象變化是由亞基亞基相互作用所介導(dǎo)的，它導(dǎo)致血紅蛋白出現(xiàn)別構(gòu)現(xiàn)象。Hb呈現(xiàn)3種別構(gòu)效應(yīng)。第一，血紅蛋白的氧結(jié)合曲線是S形的，這以為著氧的結(jié)合是協(xié)同性的。氧與一個(gè)血紅素結(jié)合有助于氧與同一分子中的其他血紅素結(jié)合。第二，H+和CO2促進(jìn)O2從血紅蛋白中釋放，這是生理上的一個(gè)重要效應(yīng)，它提高O2在代謝活躍的組織如肌肉的釋放。相反的，O2促進(jìn)H+和CO2在肺泡毛細(xì)血管中的釋放。H+、CO2和O2的結(jié)合之間的別構(gòu)聯(lián)系稱為Bohr效應(yīng)。第三，血紅蛋白對O2的親和力還受3二磷酸甘油酸（BPG）調(diào)節(jié)，BPG是一個(gè)負(fù)電荷密度很高的小分子。BPG能與去氧血紅蛋白結(jié)合，但不能與氧合血紅蛋白結(jié)合。因此，BPG是降低血紅蛋白對氧的親和力的。胎兒血紅蛋白（α2β2）比成年人的血紅蛋白 （α2β2）有較高的氧親和力，就是因?yàn)樗Y(jié)合BPG較少。導(dǎo)致一個(gè)蛋白質(zhì)中氨基酸改變的基因突變能產(chǎn)生所謂分子病，這是一種遺傳病。了解最清楚的分子病是鐮刀狀細(xì)胞貧血病。這種病人的步正常血紅蛋白稱為Hb S，它只是在兩條β鏈第六位置上的Glu倍置換乘Val。這一改變在血紅蛋白表面上產(chǎn)生一個(gè)疏水小區(qū)，因而導(dǎo)致血紅蛋白聚集成不溶性的纖維束，并引起紅細(xì)胞鐮刀狀化和輸氧能力降低。純合子的病人出現(xiàn)慢性貧血而死亡。地中海貧血是由于缺失一個(gè)或多個(gè)編碼血紅蛋白鏈的基因造成的。棉衣反映是由特化的白細(xì)胞——淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及其相關(guān)的蛋白質(zhì)之間的相互作用介導(dǎo)的。T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生T細(xì)胞受體，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，即抗體。所有的細(xì)胞都能產(chǎn)生MHC蛋白，它們在細(xì)胞表面展示宿主（自我）肽或抗原（非自我）肽。助T細(xì)胞誘導(dǎo)那些產(chǎn)生免疫球蛋白的B細(xì)胞和產(chǎn)生T細(xì)胞受體的胞毒T細(xì)胞 增殖。免疫球蛋白或T細(xì)胞受體能與特異的抗原結(jié)合。一個(gè)特定的祖先細(xì)胞通過刺激繁殖，產(chǎn)生一個(gè)具有同樣免疫能力的細(xì)胞群的過程稱為克隆選擇。人類具有5個(gè)類別的免疫球蛋白，每一類別的生物學(xué)功能都是不同的。最豐富的是IgG類，它由4條多肽鏈組成，兩條重鏈，兩條輕鏈，通過二硫鍵連接成Y形結(jié)構(gòu)的分子?？拷黋的兩“臂”頂端的結(jié)構(gòu)域是多變區(qū)，形成來年各個(gè)抗原結(jié)合部位。一個(gè)給頂?shù)拿庖咔虻鞍滓话阒唤Y(jié)合一個(gè)大抗原分子的一部分，稱為表位。結(jié)合經(jīng)常涉及IgG的構(gòu)象變化，以便域抗原誘導(dǎo)契合。由于抗體容易制取并具有高度特異性，它成為許多分析和制備生化方法的核心，如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、Western印跡和單克隆抗體技術(shù)等都得到廣泛應(yīng)用。在發(fā)動機(jī)蛋白質(zhì)中蛋白質(zhì)配體相互作用上空間和時(shí)間的組織達(dá)到相當(dāng)完善的程度。肌肉收縮是由于肌球蛋白和肌動蛋白“精心安排”的相互作用的結(jié)果。肌球蛋白是由纖維狀的尾和球狀的頭組成的棒狀分子，在肌肉中倍組織成粗絲。G肌動蛋白是一種單體，由它聚集成纖維狀的F肌動蛋白，后者是細(xì)絲的主體。由粗絲和細(xì)絲構(gòu)成肌肉收縮單位——肌節(jié)。肌球蛋白上的ATP水解與肌球蛋白頭片的系列構(gòu)象變化相偶聯(lián)，引起肌球蛋白頭從 F肌動蛋白亞基上解離并與細(xì)絲前方的另一F肌動蛋白亞基再結(jié)合。因此肌球蛋白沿肌動蛋白細(xì)絲滑動。肌肉收縮受從肌質(zhì)網(wǎng)釋放的Ga2+刺激。Ga2+與肌鈣蛋白結(jié)合導(dǎo)致肌鈣蛋白原肌球蛋白復(fù)合體的構(gòu)象變化，引發(fā)肌動蛋白肌球蛋白0相互作用的循環(huán)發(fā)生。習(xí)題，前者的解離常數(shù)Kd為106mol/L。（a）哪個(gè)蛋白質(zhì)對配體X的親和力更高？（b）將這兩個(gè)蛋白質(zhì)的Kd轉(zhuǎn)換為結(jié)合常數(shù)Ka。[（a）蛋白質(zhì)B；（b）蛋白質(zhì)A的Ka=106(mol/L)1，蛋白質(zhì)B的Ka=109(mol/L)1？（a）；（b）肺中CO2分壓從45torr（屏息）降到15torr（正常）；（c）（海平面）（高空）。[對肌紅蛋白：（a）無；（b）無；（c）無。對血紅蛋白：（a）降低；（b）增加；（c）降低]℃，CO2分壓40 torr和BPG正常勝利水平（）條件下，人全血的氧結(jié)合測定給出下列數(shù)據(jù)：p（O2） %飽和度（=100Y） 10 30 50 70 85 96 98（a） 根據(jù)這些數(shù)據(jù)，繪制氧結(jié)合曲線；估算在（1）100torr p（O2）(肺中)和（2）30 torr p（O2）（靜脈血中）下血的氧百分飽和度。（b） 肺中[100 torr p（O2）]結(jié)合的氧有百分之多少輸送給組織[30 torr p（O2）]？（c） ，利用圖617數(shù)據(jù)重新估算（b）部分。[（a）（1）98%，（2）58%；（b）約40%；（c）約50%]解：（a）圖略，從圖中克知分別為98%和58%； （b）98%58%=40%，故約40%； （c），據(jù)圖617可知：96%46%=50%。，可利用方程（615）Y/（1Y）=[ p（O2）/ P50]n計(jì)算Y（血紅蛋白氧分?jǐn)?shù)飽和度）。設(shè)P50=26 torr，n=，計(jì)算肺（這里p（O2）=100 torr）中的Y和毛細(xì)血管（這里p（O2）=40 torr）中的Y。在這些條件下輸氧效率（Y肺Y毛細(xì)血管=ΔY）是多少？除n=，重復(fù)上面計(jì)算。比較n==。并說出協(xié)同氧結(jié)合對血紅蛋白輸氧效率的影響。[n=，Y肺=，Y毛細(xì)血管=，所以，ΔY=，n=，Y肺=，Y毛細(xì)血管=，所以，ΔY=，=，差值似乎不大，但在代謝活躍的組織中p（O2）40 torr，因此潛在輸氧效率不小，參見圖615]解：Y肺/（1Y肺）=[100/26] Y肺=Y毛/（1Y毛）=[40/26] Y毛=ΔY==當(dāng)n=，同理，Y肺= Y毛= ΔY=，貯存相當(dāng)時(shí)間的血。如果這樣的血用于輸血可能會產(chǎn)生什么后果？[貯存過時(shí)的紅血球經(jīng)酵解途徑代謝BPG。BPG濃度下降，Hb對O2的親和力增加，致使不能給組織供氧。接受這種BPG濃度低的輸血，病人可能被窒息。]。為什么HbA具有這一效應(yīng)？[去氧HbA含有一個(gè)互補(bǔ)部位，因而它能加到去氧HbS纖維上。這樣的纖維不能繼續(xù)延長，因?yàn)槟┒说娜パ鮄bA分子缺少“粘性”區(qū)。]，這對于抗體識別抗原表位能告訴你什么？[該表位可能是當(dāng)G肌動蛋白聚合成F肌動蛋白時(shí)被埋藏的那部分結(jié)構(gòu)。]8．假設(shè)一個(gè)Fab半抗原復(fù)合體的解離常數(shù)在25℃和pH7時(shí)為5107mol/L。（a）結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)自由能（25℃和pH7時(shí)）是多少？（b）此Fab的親和力結(jié)合常數(shù)是多少？（c）從該復(fù)合體中釋放半抗原的速度常數(shù)為120S1。結(jié)合的速度常數(shù)是多少？此說明在結(jié)合半抗原時(shí)抗體中的結(jié)構(gòu)變化是大還是?。縖（a）ΔG0ˊ=；（b）Ka=2106mol1L；（c）結(jié)合速度常數(shù)k=2108mol1S1L，此值接近于小分子與蛋白質(zhì)相遇（結(jié)合）的擴(kuò)散控制限制（108至109mol1S1L）]。假設(shè)抗原是一價(jià)，抗體是n價(jià)，即6抗體分子有n個(gè)結(jié)合部位，且各結(jié)合部位的結(jié)合常數(shù)Ka值是相同的，則可證明當(dāng)游離抗原濃度為[L]時(shí)，結(jié)合到抗體上的抗原濃度[Lp]與抗體的總濃度[Pr]之比值，N=[Lp]/[Pr]=(nKa [L])/(1+Ka [L]) N實(shí)際上表示被一個(gè)抗體分子結(jié)合的抗原分子平均數(shù)。（a）證明上面的方程可重排為N /[L]=KanKa N此方程式稱Scatchard方程，方程表明，N/[L]對N作圖將是一條直線。（b）根據(jù)Scatchard方程，利用下列數(shù)據(jù)作圖求出抗體抗原反應(yīng)的n和Ka值。[L] mol/L N105 105 105 104 104 [（a）第一個(gè)方程兩邊各乘（1+Ka [L]），然后兩邊各除以[L]，并重排第2個(gè)方程；（b）根據(jù)第二方程，N/[L]對N作圖的斜率是Ka，N/[L]=0時(shí)的截距給出n。利用數(shù)據(jù)作圖得Ka =104 mol/L，n=。因?yàn)榻Y(jié)合部位數(shù)目只可能是整數(shù)，所以n=2]。（a） 估算在松弛和收縮時(shí)粗絲和細(xì)絲的重疊情況。（b） 一次循環(huán)中肌球蛋白沿細(xì)絲滑行“一步”，問一次收縮中每個(gè)肌動蛋白纖維需要進(jìn)行多少個(gè)步？[（a），（b）約67步]解：（a）根據(jù)P281圖635A所示，當(dāng)松弛是重疊總長度為：（1+1）（）= 當(dāng)收縮時(shí)重疊總長度為：（1+1）（）= （b）（32）247。2103247。≌67步第七章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征提要蛋白質(zhì)也是一種兩性電解質(zhì)。它的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鏈上可解離的R基團(tuán)。對某些蛋白質(zhì)說，在某一pH下它所帶的正電荷與負(fù)電荷相等，即凈電荷為零，此pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。各種蛋白質(zhì)都有自己特定的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)以上的pH時(shí)蛋白質(zhì)分子帶凈負(fù)電荷，在等電點(diǎn)以下的pH時(shí)帶凈正電荷。蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。在無鹽類干擾情況下，一種蛋白質(zhì)的質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH是它的真正等電點(diǎn)，稱為等離子點(diǎn)，它是該蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（Mr）的最重要的方法是利用超速離心機(jī)的沉降速度法和沉降平衡法。沉降系數(shù)（s）的定義是單位離心場強(qiáng)度的沉降速度。s也常用來近似地描述生物大分子的大小。凝膠過濾是一種簡便的測定蛋白質(zhì)Mr的方法。SDS聚丙乙酰胺凝膠電泳（PAEG）用于測定單體蛋白質(zhì)或亞基的Mr。蛋白質(zhì)溶液是親水膠體系統(tǒng)。蛋白質(zhì)分子顆粒（直徑1～100nm）是系統(tǒng)的分散相，水是分散介質(zhì)。蛋白質(zhì)分子顆粒周圍的雙電層和水化層是穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體系統(tǒng)的主要因素。分離蛋白質(zhì)混合物的各種方法主要根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的下列性質(zhì)：（1）分子大??；（2）溶解度；（3）電荷；（4）吸附性質(zhì)；（5）對配體分子特異的生物學(xué)親和力。透析和超過濾是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)使蛋白質(zhì)分子和小分子分開，常用于濃縮和脫鹽。密度梯度離心和凝膠過濾層析都已成功地用于分離蛋白質(zhì)混合物。等電點(diǎn)沉淀、鹽析和有機(jī)溶劑分級分離等方法常用于蛋白質(zhì)分離的頭幾步。移動界面電泳、各種形式的區(qū)帶電泳，特別是圓盤凝膠電泳、毛細(xì)血管電泳以及等電聚焦具有很高的分辨率。纖維素離子交換劑和Sephadex離子交換劑的離子交換柱層析已廣泛地用于蛋白質(zhì)的分離純化。HPLC和親和層析法是十分有效的分離純化方法。蛋白質(zhì)制品的純度鑒定通常采用分辨率高的物理化學(xué)方法，例如PAGE、等電聚焦、毛細(xì)血管電泳、沉降分析和HPLC等。如果制品是純的