矛尾復(fù)蝦虎魚病原哈氏弧菌的鑒定及它的特異性檢測方法研究畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2025-07-20 21:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 e Alignments) （maximum parsimony，MP）構(gòu)建了基于兩種基因的MP系統(tǒng)發(fā)生樹，并通過Bootstrap 法(1000 次重復(fù)) 檢驗(yàn)。 病原哈氏弧菌特異性檢測方法的研究根據(jù)GeneBank上已登錄的哈維氏弧菌gyrB基因和toxR基因各設(shè)計(jì)一對引物。以gyrB 基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)哈氏弧菌的特異性檢測引物為：A2：TCT AAC TAT CCA CCG CGG；B3：AGC AAT GCC ATC TTC ACG TTC。以toxR 基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)哈氏弧菌的特異性檢測引物vhtoxRF：TTC TGA AGC AGC ACT CAC；vhtoxRR：TCG ACT GGT GAA GAC TCA。兩對引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR反應(yīng)主要受到Mg2+、dNTP、引物和退火溫度的影響[8]。本實(shí)驗(yàn)主要研究了Mg2+的量分別進(jìn)行了20mM、25mM、30mM三種；dNTP的量分別進(jìn)行了20mM、25mM、30mM三種；引物的量分別進(jìn)行了10mM、20mM二種。接著結(jié)合引物的退火溫度設(shè)定梯度PCR的溫度范圍為50℃到65℃。利用gyrB基因特異性引物的PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min、94℃變性1min、72℃延伸2min，30個循環(huán)后72℃溫育7min。利用toxR基因特異性引物的PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、72℃延伸30s，35個循環(huán)后72℃溫育5min。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳。尋找最適的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。 哈氏弧菌敏感性檢驗(yàn)哈氏弧菌基因組DNA 2倍連續(xù)稀釋為：96ng/μL、48ng/μL、24ng/μL、12ng/μL、6ng/μL、3ng/μL、、共13個稀釋倍數(shù)，按優(yōu)化出的PCR最佳反應(yīng)條件進(jìn)行靈敏性檢測，試驗(yàn)得出檢測哈氏弧菌的最低DNA濃度。 哈氏弧菌特異性檢測方法的應(yīng)用從連云港海昌南路海產(chǎn)品批發(fā)市場上買取螠蟶、糠蝦、貝、蝦、仔、蛤、螺、蚶和海水等作為樣品來源，將其洗凈、用酒精棉消毒，取肉剪小、碾碎。將其分別裝入離心管中，先離心1分鐘，接著100℃煮沸10分鐘，20℃冷凍23分鐘，再煮沸10分鐘，最后離心1分鐘，就得到對應(yīng)海產(chǎn)品的模板DNA[9]。接著按優(yōu)化出的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖電泳，得到相應(yīng)的條帶。4 結(jié)果 分離菌的致病性供試菌株（S090801）腹腔注射感染健康矛尾復(fù)蝦虎魚后，分離菌濃度在108106的三個試驗(yàn)組，試驗(yàn)魚在3d內(nèi)全部死亡，分離菌濃度在105的試驗(yàn)組，試驗(yàn)魚在7d內(nèi)死亡2/3，分離菌濃度在104的試驗(yàn)組，試驗(yàn)魚無死亡。感染死亡魚表現(xiàn)下頜及體表出血，注射部位腫脹出血。對照組矛尾復(fù)蝦虎魚在14d觀察期內(nèi)均正常；取感染死亡魚進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果均檢驗(yàn)并分離到大量純一的同供試菌株（S090801）在形態(tài)及菌落特征上相似的菌落。試驗(yàn)證明分離菌為本次引起矛尾復(fù)蝦虎魚發(fā)生潰瘍并大量死亡的病原。被檢矛尾復(fù)蝦虎魚潰瘍組織及肝臟均分離到了菌落特征一致的大量細(xì)菌。培養(yǎng)24h檢查，在2216E培養(yǎng)基上菌落直徑多在1mm左右，圓形光滑、邊緣整齊、透明、稍隆起、灰白色；，圓形光滑、稍隆起、邊緣整齊、黃色。細(xì)菌涂片經(jīng)革蘭氏染色，特征為革蘭氏陰性、散在或成雙排列、兩端鈍圓、。分離株生化反應(yīng)結(jié)果見表1。該菌的生理和生化特征鑒定結(jié)果與哈維氏弧菌( V . harveyi ) 的特征基本一致。特性分離菌哈氏弧菌特性分離菌哈氏弧菌37℃生長++β半乳糖苷酶氧化酶++丙二酸鹽利用+接觸酶++枸櫞酸鹽利用+OF試驗(yàn)FF醋酸鹽利用+動力++酒石酸鹽利用葡萄糖：產(chǎn)酸++黏液酸鹽利用產(chǎn)氣苯丙氨酸脫氨酶乳糖蕈糖++麥芽糖+棉子糖甘露醇+果糖+甘露糖++蜜二糖蔗糖+d纖維二糖++阿拉伯糖d甲基紅阿拉伯醇VP試驗(yàn)?zāi)咎瞧咸烟卿@+半乳糖d尿素酶山梨醇H2S產(chǎn)生山梨糖乙酰胺酶衛(wèi)茅醇硝酸鹽還原++赤鮮醇吲哚苦杏仁苷DNA鼠李糖NaCl中生長：0%+糊精+1%+肌醇3%+側(cè)金盞花醇6%水楊苷d注：“＋”示陽性，“－”示陰性，“F”示發(fā)酵型，“d”示11%～89%的菌株為陽性“”示在原文中無記載。上角標(biāo)a指表中數(shù)據(jù)取自《Bergey39。s Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed》（1994）。Notes: “＋”, positive。 “－”, negative。 “F”, fermentative。 “d”, 11%～89% positive , “”, not described in primary article. “a”，the data e from《Bergey39。s Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed》 16S rRNA 和gyrB基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析分離菌（S090801）所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長度為1468bp（GenBank 登錄號：HM224413）；所擴(kuò)增的gyrB基因序列長度為1186bp（GenBank 登錄號：HM224411）。將兩種基因序列在NCBI上通過Blast進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果菌株S090801的16S rRNA和gyrB基因序列均與弧菌屬細(xì)菌的基因序列自然聚類。以副溶血弧菌（登錄號332299）作為外圍菌進(jìn)行16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示；以嗜水氣單胞菌（登錄號AF074917）作為外圍菌進(jìn)行g(shù)yrB基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。在圖1的系統(tǒng)發(fā)生樹中，分離菌（S090801）與哈氏弧菌、溶藻酸弧菌、副溶血弧菌、坎氏弧菌及輪蟲弧菌聚為一個大分支，且自舉數(shù)據(jù)值僅為54%，基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析未能將分離菌（S090801）與其它幾種弧菌有效區(qū)分。在圖2基于gyrB基因的的系統(tǒng)發(fā)生樹中，分離菌（S090801）與哈氏弧菌聚為一個分支，且自舉數(shù)據(jù)值為89%。基于兩種基因的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明分離菌（S090801）與哈氏弧菌親緣關(guān)系更近。Aeromonas hydrophila (GU596499)10Vibrio harveyi (GQ180186)Vibrio harveyi (AY750578)Vibrio harveyi (AB512466)Vibrio harveyi (AY750576)Vibrio rotiferianus (FM204864)S090801Vibrio harveyi (GU262992)Vibrio alginolyticus (EU155501)Vibrio alginolyticus (FJ981888)Vibrio parahaemolyticus (FJ172044)Vibrio parahaemol
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