矛尾復蝦虎魚病原哈氏弧菌的鑒定及它的特異性檢測方法研究畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2025-07-20 21:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 e Alignments) （maximum parsimony，MP）構(gòu)建了基于兩種基因的MP系統(tǒng)發(fā)生樹，并通過Bootstrap 法(1000 次重復) 檢驗。 病原哈氏弧菌特異性檢測方法的研究根據(jù)GeneBank上已登錄的哈維氏弧菌gyrB基因和toxR基因各設計一對引物。以gyrB 基因為靶基因設計哈氏弧菌的特異性檢測引物為：A2：TCT AAC TAT CCA CCG CGG；B3：AGC AAT GCC ATC TTC ACG TTC。以toxR 基因為靶基因設計哈氏弧菌的特異性檢測引物vhtoxRF：TTC TGA AGC AGC ACT CAC；vhtoxRR：TCG ACT GGT GAA GAC TCA。兩對引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。 PCR反應條件的優(yōu)化PCR反應主要受到Mg2+、dNTP、引物和退火溫度的影響[8]。本實驗主要研究了Mg2+的量分別進行了20mM、25mM、30mM三種；dNTP的量分別進行了20mM、25mM、30mM三種；引物的量分別進行了10mM、20mM二種。接著結(jié)合引物的退火溫度設定梯度PCR的溫度范圍為50℃到65℃。利用gyrB基因特異性引物的PCR反應條件為94℃預變性5min、94℃變性1min、72℃延伸2min，30個循環(huán)后72℃溫育7min。利用toxR基因特異性引物的PCR反應條件為94℃預變性5min、94℃變性30s、72℃延伸30s，35個循環(huán)后72℃溫育5min。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳。尋找最適的反應體系和反應條件。 哈氏弧菌敏感性檢驗哈氏弧菌基因組DNA 2倍連續(xù)稀釋為：96ng/μL、48ng/μL、24ng/μL、12ng/μL、6ng/μL、3ng/μL、、共13個稀釋倍數(shù)，按優(yōu)化出的PCR最佳反應條件進行靈敏性檢測，試驗得出檢測哈氏弧菌的最低DNA濃度。 哈氏弧菌特異性檢測方法的應用從連云港海昌南路海產(chǎn)品批發(fā)市場上買取螠蟶、糠蝦、貝、蝦、仔、蛤、螺、蚶和海水等作為樣品來源，將其洗凈、用酒精棉消毒，取肉剪小、碾碎。將其分別裝入離心管中，先離心1分鐘，接著100℃煮沸10分鐘，20℃冷凍23分鐘，再煮沸10分鐘，最后離心1分鐘，就得到對應海產(chǎn)品的模板DNA[9]。接著按優(yōu)化出的反應體系和反應條件進行PCR擴增和瓊脂糖電泳，得到相應的條帶。4 結(jié)果 分離菌的致病性供試菌株（S090801）腹腔注射感染健康矛尾復蝦虎魚后，分離菌濃度在108106的三個試驗組，試驗魚在3d內(nèi)全部死亡，分離菌濃度在105的試驗組，試驗魚在7d內(nèi)死亡2/3，分離菌濃度在104的試驗組，試驗魚無死亡。感染死亡魚表現(xiàn)下頜及體表出血，注射部位腫脹出血。對照組矛尾復蝦虎魚在14d觀察期內(nèi)均正常；取感染死亡魚進行細菌學檢驗，結(jié)果均檢驗并分離到大量純一的同供試菌株（S090801）在形態(tài)及菌落特征上相似的菌落。試驗證明分離菌為本次引起矛尾復蝦虎魚發(fā)生潰瘍并大量死亡的病原。被檢矛尾復蝦虎魚潰瘍組織及肝臟均分離到了菌落特征一致的大量細菌。培養(yǎng)24h檢查，在2216E培養(yǎng)基上菌落直徑多在1mm左右，圓形光滑、邊緣整齊、透明、稍隆起、灰白色；，圓形光滑、稍隆起、邊緣整齊、黃色。細菌涂片經(jīng)革蘭氏染色，特征為革蘭氏陰性、散在或成雙排列、兩端鈍圓、。分離株生化反應結(jié)果見表1。該菌的生理和生化特征鑒定結(jié)果與哈維氏弧菌( V . harveyi ) 的特征基本一致。特性分離菌哈氏弧菌特性分離菌哈氏弧菌37℃生長++β半乳糖苷酶氧化酶++丙二酸鹽利用+接觸酶++枸櫞酸鹽利用+OF試驗FF醋酸鹽利用+動力++酒石酸鹽利用葡萄糖：產(chǎn)酸++黏液酸鹽利用產(chǎn)氣苯丙氨酸脫氨酶乳糖蕈糖++麥芽糖+棉子糖甘露醇+果糖+甘露糖++蜜二糖蔗糖+d纖維二糖++阿拉伯糖d甲基紅阿拉伯醇VP試驗木糖葡萄糖銨+半乳糖d尿素酶山梨醇H2S產(chǎn)生山梨糖乙酰胺酶衛(wèi)茅醇硝酸鹽還原++赤鮮醇吲哚苦杏仁苷DNA鼠李糖NaCl中生長：0%+糊精+1%+肌醇3%+側(cè)金盞花醇6%水楊苷d注：“＋”示陽性，“－”示陰性，“F”示發(fā)酵型，“d”示11%～89%的菌株為陽性“”示在原文中無記載。上角標a指表中數(shù)據(jù)取自《Bergey39。s Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed》（1994）。Notes: “＋”, positive。 “－”, negative。 “F”, fermentative。 “d”, 11%～89% positive , “”, not described in primary article. “a”，the data e from《Bergey39。s Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed》 16S rRNA 和gyrB基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析分離菌（S090801）所擴增的16S rRNA基因序列長度為1468bp（GenBank 登錄號：HM224413）；所擴增的gyrB基因序列長度為1186bp（GenBank 登錄號：HM224411）。將兩種基因序列在NCBI上通過Blast進行同源性檢索，結(jié)果菌株S090801的16S rRNA和gyrB基因序列均與弧菌屬細菌的基因序列自然聚類。以副溶血弧菌（登錄號332299）作為外圍菌進行16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育學分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示；以嗜水氣單胞菌（登錄號AF074917）作為外圍菌進行g(shù)yrB基因系統(tǒng)發(fā)育學分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。在圖1的系統(tǒng)發(fā)生樹中，分離菌（S090801）與哈氏弧菌、溶藻酸弧菌、副溶血弧菌、坎氏弧菌及輪蟲弧菌聚為一個大分支，且自舉數(shù)據(jù)值僅為54%，基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析未能將分離菌（S090801）與其它幾種弧菌有效區(qū)分。在圖2基于gyrB基因的的系統(tǒng)發(fā)生樹中，分離菌（S090801）與哈氏弧菌聚為一個分支，且自舉數(shù)據(jù)值為89%?；趦煞N基因的系統(tǒng)發(fā)育學分析表明分離菌（S090801）與哈氏弧菌親緣關系更近。Aeromonas hydrophila (GU596499)10Vibrio harveyi (GQ180186)Vibrio harveyi (AY750578)Vibrio harveyi (AB512466)Vibrio harveyi (AY750576)Vibrio rotiferianus (FM204864)S090801Vibrio harveyi (GU262992)Vibrio alginolyticus (EU155501)Vibrio alginolyticus (FJ981888)Vibrio parahaemolyticus (FJ172044)Vibrio parahaemol
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