【文章內(nèi)容簡介】 浮于2m1 ／L冷CaCl2溶液，并置于冰浴中。 （%的無菌甘油70℃保存）6．取3支1．5ml離心管，按下表加試劑和操作：試 劑管1管2管3連接產(chǎn)物10μl質(zhì)粒(100ng／μ1)1μlH2O9μl10μl感受態(tài)細胞200μl200μl200μl 7．冰浴中放置30min。 8．42℃熱沖擊90s后，立即放入冰浴,放置2－5分鐘。 9．。 10．37℃劇烈振搖培養(yǎng)60min。（轉(zhuǎn)速不低于225RPM） 11．5000r／min離心1min, 棄去上清液保留培養(yǎng)基100～200μl，充分懸浮細菌，分別涂布于含氨芐青霉素的LB平板，加入的菌液用玻棒均勻推開。以上操作均需在無菌條件下進行。平板在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日觀察各平板上菌落生長情況，并算出轉(zhuǎn)化率即每微克DNA能轉(zhuǎn)化多少個細菌。注意事項 1．致敏緩沖液中試劑的純度與濃度對轉(zhuǎn)化率影響很大，試劑必須為分析純，同時，致敏緩沖液最好避光貯存于40C。 2．制備感受態(tài)細胞的全部操作均須于冰浴低溫操作，同時注意無菌操作，防止感受態(tài)細胞受雜菌污染。3．42℃熱處理時間很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確，同時注意熱處理過程中離心管不要搖動。4．菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。5．實驗用的玻璃器皿、微量吸管及Eppendorf管等，應(yīng)徹底洗凈并進行高壓消毒，表面去污劑及其他化學(xué)試劑的污染往往大幅度地降低轉(zhuǎn)化率。【思考題】？如何提高轉(zhuǎn)化率？？ 實驗六 PCR擴增基因特異片段實驗?zāi)康模? 學(xué)習(xí)PCR體外擴增的原理及其引物設(shè)計原則；了解擴增過程中各因素對擴增結(jié)果的影響；掌握PCR的基本操作。實驗原理 PCR(polymerase chain reaction)是在體外進行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng)。在分子生物學(xué)研究中，廣泛地應(yīng)用于研究基因突變，獲取加上酶切位點的目的基因和DNA序列測定等方面，是分子生物學(xué)中一項極為常用的技術(shù)。 PCR的原理是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個引物分別位于靶序列的兩端，同兩條模板的3＇端互補，由此限定擴增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性——退火——延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低的溫度下同過量的引物退火，再在適中的溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。由于每一循環(huán)的產(chǎn)物都可作為下一循環(huán)反應(yīng)的模板，因此擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)級方式增加。理論上，經(jīng)過n次循環(huán)可使特定片段擴增到2n1，考慮到擴增效率不可能達到100％，實際上要少些，通常經(jīng)25～30次循環(huán)可擴增106倍，這個量足夠分子生物學(xué)研究的一般要求。 (一)PCR引物設(shè)計 1．Tm值 Tm值是PCR引物設(shè)計中的一個重要參數(shù)，是指引物與模板之間精確互補并且在模板過量的情況下有50％的引物與模板配對，而另外50％的引物處于解離狀態(tài)時的溫度，Tm值一般高于55℃。合適的引物選擇應(yīng)需考慮到以下因素，如Taq酶的最適溫度(TE)和Tm值等。最常用的Taq酶的最適溫度(TE)范圍為70～74℃，根據(jù)TE可以先確定一個合適的退火溫度范圍(Ta)。這個溫度范圍應(yīng)不高于酶的最適反應(yīng)溫度，也不能比TE－25℃更低。這是因為如果退火溫度低于酶的最適反應(yīng)溫度時，酶的合成反應(yīng)會非常緩慢，但片面考慮提高溫度又會造成引物脫落而不能進行PCR擴增。所以Ta的選擇應(yīng)滿足TE25℃TaTE。 2．引物的長度 引物長度一般在15～30個核苷酸之間比較合適。引物過短時造成Tm值過低，不能與模板很好地配對或是配對專一性很低。引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶的最適反應(yīng)溫度，還使合成引物的費用大大增加。當(dāng)然若要在引物的5＇末端加上特定的酶切位點等堿基則可稍長。 3．引物的GC％含量 引物的GC比最好設(shè)計在40％～60％的范圍內(nèi)。GC比過高與過低都會直接造成Tm值的過高與過低。如上所述，Tm值的估計可簡單地根據(jù)經(jīng)驗式Tm＝4GC+2AT+℃獲得。 4．引物3′端起始堿基 Taq酶在3′末端錯配時延伸效率是不一樣的，延伸效率為TG＝CA。即當(dāng)引物3′末端為A時，即使有錯配堿基也最不易延伸，所以引物設(shè)計時可將3′末端設(shè)計為A，以提高復(fù)制精確性。另一種理論是3′末端應(yīng)設(shè)計為G或C，因為G和C的氫鍵多于A與T，能更好地與模板結(jié)合開始DNA合成，當(dāng)然對錯配延伸效率方面就不能苛求了?？偠灾锏?′末端不要考慮使用T。 5．引物無發(fā)卡結(jié)構(gòu) 引物自身應(yīng)無發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 6．二引物自身之間不能配對 二引物自身不能配對是指同一對引物之間不能有配對的多個堿基，特別是在引物的3′末端。二引物間不能配對的道理與二引物本身不能配對相同，若發(fā)生這種情況會形成引物二聚體，造成擴增失敗。一般引物自身配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不大于3，兩條引物間配對堿基數(shù)小于5個。7．二引物的Tm值 引物設(shè)計時應(yīng)注意使二引物的Tm值相近，否則二個引物必然不能同時達到最佳退火溫度，將會影響PCR擴增效果。能同時達到最佳退火溫度，將會影響PCR擴增效果。由于影響引物設(shè)計的因素比較多，所以常利用計算機來輔助設(shè)計，通常可用primer 。 (二)PCR反應(yīng)條件 1．PCR緩沖液 常用的1PCR緩沖液為10mmol／L TrisHCl (常溫)，50mmol／L KCl，／L MgCl2。由試劑公司與Taq酶一起提供。 (1)Mg2+離子濃度：Mg2+離子濃度對PCR反應(yīng)影響很大，因為[Mg2+]與引物模板及產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成、產(chǎn)物的忠實性、酶活力、產(chǎn)物的產(chǎn)量等諸多因素有關(guān)。Mg2+～／L，／L梯度間隔做Mg2+最適濃度試驗。 (2)dNTP：常用dNTP濃度為20μmol／L(可用范圍為20～200μmol／L)。dNTP的用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物忠實性有關(guān)，dNTP量過少時合成的產(chǎn)物減少?？梢员籘aq酶接受的經(jīng)過修飾的dNTP有以下幾類：dig11dUTP、5—bromodUTP、biotin11—dUTP、biotin16—dUTP、7—deazadGTP和次黃嘌呤。但不是所有的聚合酶都能接受經(jīng)過修飾的dNTP。 (3)K+離子濃度：PCR反應(yīng)中K+離子的作用是促進Taq酶活力與促進引物退火，一般使用濃度是50mmol／L，但當(dāng)K+離子濃度高于50mmol／L時會抑制Taq酶活力。 (4)pH值：PCR反應(yīng)中用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)。TrisHCL緩沖系統(tǒng)的特點是具有很高的溫度系數(shù)(／℃)，20℃℃延伸反應(yīng)時，實際pH值降低至7．2。而Tricine的溫度系數(shù)較高，在擴增長片段時用Tricine系統(tǒng)。 (5)保護劑：由于PCR反應(yīng)體系中蛋白的含量極低，所以加人的酶非常容易變性，通常需加入一定量的保護劑。如5mmol／L的二硫蘇糖醇(DTT)，100μg／ml的小牛血清白蛋白(BSA)％的明膠。加入保護劑對PCR循環(huán)數(shù)較多的擴增反應(yīng)效果尤其明顯。2．模板 PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反轉(zhuǎn)錄后再擴增。模板可以是基因組DNA或純化的質(zhì)粒DNA，當(dāng)然兩者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每個PCR反應(yīng)中加入的模板數(shù)量可在102～105分子之間，必要時可低至50個分子，模板的量少時應(yīng)酌情增加循環(huán)次數(shù)。小于100ng的哺乳動物細胞基因組DNA(相當(dāng)于約104個細胞)，經(jīng)30個循環(huán)，10％的反應(yīng)物應(yīng)能夠在溴化乙錠染色的凝膠上看到一條主要產(chǎn)物帶。使用較大量的模板時，循環(huán)數(shù)可減少；如果模板量很少，可能需要增加至45個循環(huán)反應(yīng)。3．引物濃度 ～／L。隨著引物濃度的降低，PCR反應(yīng)的特異性提高但產(chǎn)物得率降低；隨著引物濃度的升高，情況正好相反。 4．PCR反應(yīng)中的酶 Taq酶最早是從水生嗜熱菌(thermus aquaticus)中分離得到的，該酶的最適溫度是72℃，在94℃時相當(dāng)穩(wěn)定，半衰期長達38min。由于這種酶使用最早最廣泛，文獻中所列各項最適反應(yīng)條件都是針對此酶優(yōu)化的，使用其它的聚合酶時按試劑盒使用說明書操作。實驗內(nèi)容儀器和試劑1．儀器 PCR儀，微型水平電泳槽，電泳儀等。2．試劑（1）50TAE電泳緩沖液（2）10PCR緩沖液：（3）4種dNTP混和液10mmol/L（4）Pfu DNA聚合酶（5U/μl）（5）引物（20μM）（6）10溴酚藍上樣緩沖液方法和步驟1. 在PCR儀上設(shè)置好程序。2. ，按下列順序加樣，建立20μl反應(yīng)體系。ddH2015μl10PCR Buffer2μldNTP(10mM each)Primer l(20μM)Primer 2(20μM)模板DNA (50ng)D16Pfu DNA聚合酶（） 1μl總體積 20μl對照水（空白對照） 3．混勻，短暫離心． 4．放在PCR儀上進行PCR反應(yīng)。94℃變性3min，94℃45秒，64℃ 1分鐘，72℃3分鐘，20個循環(huán)。（用舊式的PCR儀進行基因擴增時還要求覆蓋約50μl (一滴)液體石蠟油，改進后的PCR儀已經(jīng)不用液體石蠟油覆蓋。）5 . 取5μl PCR反應(yīng)液及1μl上樣緩沖液混合，進行瓊脂糖電泳(5V／cm)，選擇適當(dāng)大小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000），檢查擴增產(chǎn)物。紫外觀察，必要時拍照。注意事項，因此，在進行PCR前，模板的純化和引物設(shè)計尤為重要。+對Taq DNA聚合酶的活性影響很大，有時按照試劑商提供的說明擴增不出目的基因時，不妨適當(dāng)增加Mg2+的濃?！舅伎碱}】1. PCR的原理是什么？2. PCR中引物和TaqDNA聚合酶各有什么作用？3. PCR中怎樣預(yù)防出現(xiàn)假陽性結(jié)果？ 4. 什么是Tm值？有何用途？如何計算？ 5. 引物設(shè)計應(yīng)遵循什么原則？ 6. 你會使用哪種引物設(shè)計軟件？實驗七 DNA片段的回收及純化實驗?zāi)康? 了解瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA片段的常用方法，掌握根據(jù)實際情況選用方法的原則，并用試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物DNA片段。實驗原理 DNA片段的分離與回收是基因工程操作中一項重要的技術(shù)，例如可收集特定酶切片段用于克隆或是制備探針，回收PCR產(chǎn)物用于再次鑒定等?；厥諏嶒炛袃蓚€最重要的技術(shù)指標(biāo)是產(chǎn)物的純度與回收率：純度未達標(biāo)時會嚴(yán)重影響以后的酶切、連接、標(biāo)記等酶參與的反應(yīng)；回收率不理想時往往會大大增加前期工作量。 1．低熔點膠法 低熔點膠是向普通瓊脂糖的多糖鏈上引入羥乙基形成的，這一變化會使凝膠的熔化點與凝固點均降低。低熔點膠在30℃時凝結(jié)、65℃時熔化，這一溫度尚不足以使DNA分子變性。操作時可先灌一塊普通的膠，然后用低熔點膠取代其中的回收部分。割下的膠加入TE后于65℃保溫促使凝膠熔化，再加入等體積的酚抽提去除凝膠。低熔點膠的另一個特點是電泳回收后可以立即進行酶切連接、標(biāo)記等酶反應(yīng)，因為這類膠中不含有普通瓊脂糖中抑制酶活性的硫酸鹽等雜質(zhì)，并且收集的膠條能在酶反應(yīng)的合適溫度(37℃)始終保持液體狀態(tài)。 2．玻璃粉(乳)法 將膠條割下加入NaI溶液浸泡，劇烈振蕩數(shù)分鐘促使溶膠。向膠液中加入經(jīng)酸凈化處理的極細玻璃粉(乳)，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)離心管使DNA吸附于其上。離心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保溫，洗脫吸附于玻璃粉上DNA，再次離心收集含DNA的上清液即可?！?kb的小分子片段，均有80％的回收率。 3．QIAgen膠回收試劑盒 由于凝膠溶于含NaI的溶膠液，DNA能專一地與離心柱中纖維素結(jié)合。結(jié)合后的DNA經(jīng)洗滌除去雜質(zhì)，最后在低鹽緩沖液中經(jīng)離心從纖維素上洗脫下來。 4 其他試劑盒，本實驗采用的是北京塞百盛生物技術(shù)公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒。基本原理是，在高鹽狀態(tài)下，純化樹脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來。此法簡便快捷，可在幾分鐘內(nèi)從PCR反應(yīng)液，或十幾分鐘內(nèi)從普通瓊脂糖凝膠中回收高純度的PCR產(chǎn)物，用于DNA測序及其它酶促反應(yīng)。其回收率分別為85%和70%左右。該系統(tǒng)不僅用于純化PCR產(chǎn)物，還可以從反應(yīng)液或普通瓊脂糖凝膠中回收各種類型的DNA片段，適用范圍從150bp到十幾kb。實驗內(nèi)容試劑與器材 試劑 (1)瓊脂糖 (2)TAE電泳緩沖液 (3)10DNA電泳樣品緩沖液 (4)無菌水 (5)PCR產(chǎn)物(6)溴化乙錠（EB）（7）試劑盒包裝及組成純化樹脂 （于GS結(jié)合液中）20ml離心純化柱（空柱子）50套（8）80%異丙醇或80%乙醇 （9）超純水或TE緩沖液儀器(1)臺式高速離心機(2)水浴鍋13(3)電泳器材實驗步驟 1. 將無石蠟油的PCR反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液（50μl~100181。l反應(yīng)體系）在1%的普通瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需的DNA條帶裝入2ml離心管中。盡量切掉不含DNA的瓊脂糖凝膠，這樣可簡化操作、提高回收量及DNA片段的質(zhì)量。 2. 200mg~（使用前充分混勻），70℃保溫5~10分鐘，每兩分鐘顛倒混勻1次，使瓊脂糖凝膠完全融化。 對于高濃度的瓊脂糖凝膠（2%），加熱融膠的時間延長到15分鐘。 3. 將混和液轉(zhuǎn)移入離心純化柱，13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。 4. 加入500181。l 80%異丙