【文章內(nèi)容簡介】 許多酶延長其反應(yīng)時間可減少酶的用量 在 16hr反應(yīng)時間所需正常酶量的比率 EcoRI (1/8) HindIII (1/8) KpnI(1/4) BamHI(1/2) HaeIII(1/1) (四 ) 反應(yīng)終止 1. EDTA 終 10mM 2. 加熱 37℃ 酶 在 65℃ 處理 20min, otherwise 80℃ 20min 3. 其它 DNA純化 (苯酚 ,試劑盒 ) 在 80℃ 20min不失活的酶 : 37℃ ： Bg1II HpaI PvuII 65℃ ： Tth111I TspRI 50℃ ： Bc1I 七、星星活性 (star activity) 非特異性切割 在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性 1. 概念 實際上星星活性是限制內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點。 ApoI、 AseI、 BamHI、 BssHII、 EcoRI、 EcoRV、 HindIII、Hinf KpnI、 PstI、 PvuII、 SalI、 ScaI、 TaqI、 XmnI 2. 酶的特異性變化方式 與酶的種類和所應(yīng)用的條件有關(guān) 最普遍的活性變化 : 1個堿基的變化 。 識別位點外層堿基的隨意性 。 以及單鏈缺口 EcoRI的研究表明 ? pH的升高和離子強度的降低 , 可切割 N/AATTN ? 切割只有一個堿基不同的序列 (但這個變化的堿基在中央序列 , 以及 AATT中不是 A到 T或 T至 A的變化 ) 3. 引起星星活性的因素 ① 高濃度甘油（ 5%） ② 酶過量（ 100U/?g） ③ 低離子強有力度（ 25mM） ④ 高 pH () ⑤ 有機溶劑 PMSD(二甲基亞砜 )、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺 (dimethylformamide), sulphalane ⑥ 用其它二價陽離子代替 Mg++ Mn++， Cu++， Co++, Zn++ 不同的酶對上述條件的敏感性不一樣 PstI比 EcoRI對高 pH更敏感 但后者對甘油濃度更敏感 星星活性在絕大多數(shù)情況下，是可控制的 4. 抑制星星活性的條件（措施） ① 減少酶的用量，避免過量酶切 ,減少甘油濃度 ② 保證反應(yīng)體系中無有機溶濟(jì)或乙醇 ③ 提高離子強度到 100～ 150mM (如果不會抑制的話 ) ④ 降低反應(yīng) pH至 ⑤ 使用 Mg++作為二價陽離子 ?X174 (5386 bases) M13mp18 (7249bases), Wild M13 phage 6407base 八、單鏈 DNA的切割 Cleavage of singlestranded DNA HinP1I, HhaI, MnlI at 50% of the rate of dsDNA HaeIII 10% BstNI, DdeI, HgaI, HinfI, TaqI 100倍慢 不切割： AluI, BbvI, DpnI, FnuDII, FokI, HpaII, HphI, MobI, MobII, MspI, Sau3AI, SfaNI 1. 外因 反應(yīng)條件 底物的純度 (雜質(zhì) , 污染 鹽 酚 ) 九、影響活性的因素 2. “內(nèi)因” ① 星星活性 ② 甲基化 ③ 底物的構(gòu)象 /位點 1. 產(chǎn)生的 5’突出端補平后連接 EcoRI GAATTC CTTAAG 十、 酶切位點的引入 （酶切水平） ...CTCGAGGAATTCCTGCAG... ...GAGCTCCTTAAGGACGTC... XhoI EcoRI PstI ...CTCGAGG AATTCCTGCAG... ...GAGCTCCTTAA GGACGTC... XhoI PstI ...CTCGAGG AATTCCTGCAG... ...GAGCTCCTTAA GGACGTC... XhoI PstI AATT TTAA ...CTCGAGGAATTAATTCCTGCAG... ...GAGCTCCTTAATTAAGGACGTC... XhoI PstI AseI XmnI 酶切 補平 連接 HindIII AAGCTAGCTT TTCGATCGAA AluI NheI 2. 同尾末端的連接 BamHI(G/GATCC) + BclI (T/GATCA) AlwI (GGATC 4/5) PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC) MobI (GATC) 十一、 酶切位點在基因組中分布的不均一性 GC% 酶切位點出現(xiàn)的機率 BamHI GGATCC EcoRI GAATTC 在基因組中，堿基對的排列是非均勻的 因此盡管 GC含量相同的酶切位點，在基因組中出現(xiàn)的機率是不一樣的 平均片段大小在 AscI(GGCGCGCC) 20kb NotI(GCGGCCGC) 200kb EcoRI/HindIII 5kb SpeI(ACTAGT) 60kb 細(xì)菌基因組 在大多數(shù)富含 A+T的細(xì)菌中， CCG和 CGG的排列是最少見的，所以含有這兩種序列的識別序列出現(xiàn)的機率就非常少 酵母基因組 G+C%為 38%，因此在重復(fù)序列之外 (tRNA or Ty elements)，富含 G+C的識別序列就特別少 哺乳動物 細(xì)胞核基因組的 G+C為 41%，其中 CG的序列比想象的低 5倍之多，因此含CG序列的酶切位點在哺乳動物細(xì)胞就相當(dāng)稀少。 但是在哺乳動物細(xì)胞中，大多數(shù) CG序列是甲基化的 第二節(jié) 甲基化酶 Methylase Methylation 一、 甲基化酶的種類 在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶， 在 的 DNA甲基化酶 1. Dam甲基化酶 識別位點 GATC, 在腺嘌呤 N6位置 引入甲基 ? PvuII BamHI BclI BglII XhoII MboI Sau3AI 識別位點中含 GATC序列 ? ClaI(1/4) XbaI (1/16) TaqI (1/16) MboII (1/16) HphI(1/16) 部分識別序列含 GATC序列 4個 ClaI位點 (ATCGATN)中有一個該序列 有些限制酶對 Dam甲基化敏感 不能切割相應(yīng)的序列 BclI, ClaI, MboI, XbaI 等 不敏感的有 BamHI, Sau3AI, BglII, PvuI等 一般哺乳動物 DNA 不會在 AN6上甲基化 當(dāng)需要在敏感位點上完全切割 DNA時，必須從dam DNA 2. Dcm甲基化酶 識別 CCAGG或 CCTGG序列 在第二個 C上 C5位置上引入甲基 EcoRII / BstNI CCA(T)GG 二者識別序列相同，但切點不同 EcoRII受 dcm甲基化作用影響 BstNI可避免這一影響 受影響酶有： Acc65I GGTACC AlwNI ApaI GGGCCC EcoRII EaeI 等 不受影響酶有： KpnI GGTACC BanII Bg1I BstNI NarI GGCGCC 等 3. EcoKI甲基化酶 識別 AAC(N)6GTGC GCAC(N)6GTT 但識別位點少 (1/8kb) 研究較少 而 dam（ 1/256bp） dcm(1/512bp) 4. SssI甲基化酶 來自原核生物 Spiroplasma CG序列中的 C在 C5位置上甲基化 可在未甲基化或半甲基化鏈上起作用 A的 N6位置 許多酶對此甲基化敏感 AatII ClaI XhoI SalI等 不敏感的有 BamHI EcoRI SphI KpnI SssI甲基化的 DNA 受 McrA, McrBC, Mrr 系統(tǒng)的限制 5. 其它甲基化酶 二、 依賴于甲基化的限制系統(tǒng) 3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng) 識別的序列各不相同，但只識別經(jīng)過甲基化的序列 mcrA, mcrBC, mrr ? 都限制由 CpG甲基化酶 (MSssI)作用的 DNA ? Mrr也限制 m6A ? McrBC 切割兩套位點（ G/A） mC，這兩套位點之間間隔 2kb，最適為 55～ 103bp，需 GTP 大多數(shù)常用的 三個都不限制 Dam, EcoKI , EcoRI修飾的位點 McrA限制 HpaII甲基化修飾的位點 三、 甲基化對限制酶切的影響 1. 修飾酶切位點 ① HincII GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC TCGA中的 A，所以 DNA后， GTCGAC將不受 HincII切割 ② BamHI GGATCC m5CCGG 如果 BamHI前面為 CC或后面為 GG， 那么 DNA抵抗 BamHI的切割 ③ 構(gòu)建 DNA文庫時 ? 用 AluI(AG↓CT)和 HaeIII(GG↓CC)部分消化基因組DNA ? ，然后加上合成的 EcoRI接頭 ? 當(dāng)再用 EcoRI來切割時只有接頭上的位點可被切割 2. 產(chǎn)生新酶切位點 TCGATCGA AGCTAGCT TaqI TaqI TCGA*TCGA* *AGCTAGCT DpnI 3. 用于研究細(xì)胞 DNA中位點特異性甲基化的水平及分布 哺乳動物 m5CG、植物的 m5CG， m5CNG 腸道細(xì)胞的 Gm6ATC C m5/4 CGG MspI可切割， HpaII不可切割Gm6ATC Sau3AI 可切割， MobI不可切割 其它 4. 對基因組作圖的影響 在哺乳動物 DNA CpG序列出現(xiàn)的頻率大約只有預(yù)計的 1/5 含 CpG序列的識別序列極其稀少 大多數(shù) CpG都發(fā)生甲基化 含 CpG的所有識別序列的酶不能切割 CpG甲基化大多數(shù)不完全 對酶切位點稀少的酶來說 在其識別位點上的甲基化具可變性 第三節(jié) DNA聚合酶 DNA polymerase 催化 DNA的合成 (模板 /引物 /dNTP等 )及其相輔的活性 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 真核細(xì)胞有 4種 DNApoly ?：也許是復(fù)合物，位于細(xì)胞核內(nèi)，有催化細(xì)胞增生的作用。 ?：小分子蛋白質(zhì)（ ）曾從小牛胸腺出大是出，與細(xì)胞增生無關(guān)。 ?： 100kDa，利用 RNA為模板的效率比利用 DNA為模板的效率高。 其它：線粒體 DNA聚合酶、催化線粒體DNA的合成。 原核細(xì)胞三種 DNA聚合酶，都與 DNA鏈的延長有關(guān) I．單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈 DNA的延長 II 與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān) III 在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長的主要酶 1. 活性 單鏈多肽 (109kDa) 三種活性 ① 5‘→3 ‘DNA聚合酶活性 底物 : 模板 (ssDNA), 引物（帶 3?OH基） 或 5