【文章內容簡介】 ? 質粒 DNA占總 DNA的 1%～ 2%； ? 在細胞裂解及 DNA分離過程中，大分子量的細菌染色體易斷裂成線性片斷，而質粒 DNA分子量小，結構緊密仍保持完整的狀態(tài)； ? 染色劑溴化乙錠（ EB）能摻入到 DNA鏈的堿基中，導致鏈的解旋；而且形成的 EBDNA復合物中， EB含量越高，密度會越低（完整的質粒DNA結合 EB少，密度大）。 離心流程 ? 離心收集菌體，加入溶菌酶或 SDS，促進大腸桿菌細胞裂解，離心收集含質粒 DNA的上清。 ? 將 EB的 CsCl溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中， EB會嵌入到 DNA鏈的堿基中。 ? 在 EB達到飽和時，進行氯化銫密度梯度離心。 ： 原理： cccDNA與線性染色體 DNA片斷之間，拓撲學上存在差異 ? 在 ～ ： 線性的 DNA雙螺旋 結構解開而被變性； 共價閉環(huán)質粒 DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。 ? 恢復 pH值中性時： 共價閉合環(huán)狀的質粒 DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，恢復原來構型，保持可溶性狀態(tài)。 線性染色體 DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網狀結構。 ? 通過離心，去除線性染色體 DNA與不穩(wěn)定的大分子 RNA，蛋白質 SDS復合物等，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質粒 DNA。 ? 挑取單個菌落接種到 5ml含適當抗菌素的 LB培養(yǎng)基中， 37℃ 搖床培養(yǎng)過夜。 ? 取 Eppendorf管中， 5000rpm離心 1min，棄上清， ? 沉淀 懸浮 于 150μl 溶液 Ⅰ （ 500mmol/L葡萄糖， 25mmol/L TrisHCl， 10mmol/L EDTA， pH ）冰浴 5分鐘； 此步驟菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊，否則會降低抽提得率。 ? 加入新配置的 200μl 溶液 Ⅱ （ ， 1%SDS），混勻，冰浴 10分鐘。 這一步操作要注意兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組 DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組 DNA也會斷裂。 ? 加入 150μl 溶液 Ⅲ （ 3mol/L乙酸鉀 ， ），冰浴 5分鐘； 堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，否則最后得到的質粒上會有大量的基因組 DNA污染。 ? 12022rpm離心 3分鐘，轉移上清至新的離心管； ? 加入等體積酚 /氯仿抽提一次；轉移上層水相至新的離心管； ? 等體積氯仿抽提一次。 ? 取上清，加入 2倍體積無水乙醇，混勻， 20℃ 沉淀 30分鐘； ? 12022rpm離心 5分鐘。 ? 70%乙醇洗滌沉淀一次； ? 干燥后加入 50μl 含 RNA酶（ 20ug/ml）的 TE（ 10mmol/L TrisHCL， 1mmol/L EDTA， pH ）， 37℃ 水浴 30分鐘。 20℃ 保存?zhèn)溆谩? 質粒的小量提取 堿裂解法 自 Qiagen公司推出快速小量提取質粒 DNA試劑盒以來，很多公司都開發(fā)出類似產品，其原理及實驗步驟大同小異。具體步驟如下 (天為時代 )： ? 挑取單菌落接種于 5ml含適當抗菌素的 LB培養(yǎng)基中， 37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜； ? 取 Eppendorf管中， 13000rpm離心 1min，棄上清，加入 250ul S1 Buffer,最大速度旋渦震蕩； ? 加入 250ul S2 Buffer， 輕輕顛倒混勻 46次； ? 加入 350ul S3 Buffer， 立即迅速顛倒混勻，可見白色絮狀沉淀； ? 將上清加入純化柱中， 5000rpm離心 10min； ? 棄去收集管中液體，加入 500ul除蛋白液 PD Buffer， 13000rpm離心 1min； ? 棄去收集管中液體；加入 700ul PE Buffer， 13000rpm離心 1min； ? 棄去收集管中液體；加入 500ul PE Buffer， 13000rpm離心 1min； ? 棄去收集管中液體； 13000rpm離心 3min，以徹底去除乙醇； ? 將柱子放到一只干凈的 Eppendorf管中，加入 50μl ddH2O ； ? 靜止放置 2min, 13000rpm 離心 1min,收集離心液， 20℃ 保存。 質粒的小量提取 堿裂解法（試劑盒） ? 挑取單菌落接種 5毫升含適當抗菌素的 LB培養(yǎng)基中， 37℃ 震蕩培養(yǎng)過夜。 ? 將培養(yǎng)物轉接 200ml含同樣抗菌素的 LB培養(yǎng)基中， 37℃ 劇烈振蕩培養(yǎng) 1216小時，細菌密度 (OD600nm)達到 ； ? 5000rpm離心 15分鐘，棄上清； ? 重懸細菌于 100ml冰預冷 STE （ ， 10mmol/L TrisHCl， 1mmol/L EDTA， pH ）。 ? 5000rpm離心 15分鐘，棄上清； ? 加 10ml溶液 1（ 50mmol/L葡萄糖， 25mmol/L TrisHCl， 10mmol/L EDTA， ）重懸，混勻，冰浴 10分鐘； ? 加入 20ml新配置的 溶液 2（ ,1%SDS），混勻，冰浴 10分鐘； ? 加入 15ml預冷的 溶液 3（ ， pH ），混勻，冰浴 10分鐘； ? 10000rpm離心 15分鐘，棄沉淀； ? 加入等體積的預冷異丙醇，混勻， 20℃ 沉淀 1小時； ? 10000rpm離心 15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥； ? 用 3 ml TE（ 10mmol/L TrisHCl， 1mmol/L EDTA， pH ）溶解沉淀； ? 加入 3 ml冰預冷的 5mol/L LiCl溶液，充分混勻， 10000rpm離心 15分鐘，棄沉淀； ? 上清中加入等體積冰預冷的異丙醇，充分混勻， 10000rpm離心 15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥； ? 500μl 含 RNA酶（ 20ug/ml） TE（ 10mmol/L EDTA， ）溶解沉淀，轉移到 Eppendorf管中，室溫放置 30分鐘； ? 加入 500μl 含 13%聚乙二醇 8000的 ，充分混勻， 20℃ 沉淀 2小時； ? 于臺式離心機上 12022rpm離心 10分鐘，棄上清； ? 加入 400μl TE （ ）溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次； ? 轉移水相至新的 Eppendorf管，加 100μl 10M 乙酸銨，充分混勻； ? 加 2倍體積無水乙醇， 20℃ 沉淀 1小時； ? 12022rpm離心 10分。用冰預冷的 70%乙醇洗滌沉淀一次，晾干； ? 50μl TE （ pH ）溶解沉淀，儲存于 20℃ 冰箱。 質粒的大量提取 聚乙二醇沉淀法 分子克隆步驟 轉化及感受態(tài)細胞 ★ 目前常用的原核細胞轉化方法有兩類： 電穿孔轉化法、化學轉化法 ★ 電穿孔轉化法屬于物理方法，但由于受到儀器的限制，實驗室更常用的是化學轉化法。 ★ 化學轉化法原理：利用低溫（ 0℃ ）和 CaCl2低滲溶液的處理，使宿主細胞處于容易吸收外源 DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)（ petence cell）。此時菌體膨脹成球形，細胞壁和膜的通透性增強。 DNA與 Ca2+形成的羥基 磷酸鈣復合物黏附于菌體表面， 42℃ 短暫熱沖擊處理（熱休克）后，黏附表面的重組 DNA被吸收進入宿主細胞，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長 1小時左右，細胞形態(tài)復原，進入增殖分裂期。 ? 挑取單菌落，接種無抗菌素的 LB培養(yǎng)基， 37℃ 搖床培養(yǎng)過夜。 ? 次日按 1： 100轉種新鮮 LB培養(yǎng)基，繼續(xù)搖床培養(yǎng) 2小時左右，至菌液 OD 600nm值為 。 ? 置冰上預冷 10分鐘，然后 4℃ 、 5000rpm離心 10分鐘，棄上清； ? 以 10ml冰預冷的 ，放置于冰浴中 20分鐘； ? 4℃ 、 5000rpm離心 10min，棄上清； ? 按每 50ml培養(yǎng)物加入 2ml冰預冷的 ，再加入 15%體積滅菌甘油，混勻，然后分裝于 Eppendorf管中， 70℃低溫冰箱中保存。 感受態(tài)宿主菌的制備 氯化鈣法 1．前夜接種受體菌（ DH5?、 DH10B），挑取單菌落于 LB培養(yǎng)基中 37℃ 搖床培養(yǎng)過夜； 2．取 2ml過夜培養(yǎng)物轉接于 200ml LB培養(yǎng)基中，在 37℃ 搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至 OD600=； 3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作； 4．吸取 ，在冰上冷卻 10分鐘； 5． 4℃ 下 3000g冷凍離心 5分鐘； 6．棄去上清，加入 1500?l冰冷的 10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??； 7． 4℃ 下 3000g冷凍離心 5分鐘 8．棄去上清，加入 750?l冰冷的 10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??； 9． 4℃ 下 3000g冷凍離心 5分鐘 10．加入 20?l冰冷 10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮； 11．立即使用或迅速置于 70186。C超低溫保存。 感受態(tài)宿主菌的制備 電轉化法 感受態(tài)宿主菌的制備 注意事項 1．細菌的生長狀態(tài)：實驗中應密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用 對數生長期的細胞（一般通過檢測 OD600來控制。 DH5?菌株 OD600為 5 107/ml）； 2 ．所有操作均應在 無菌條件和冰上 進行； 3 ．經 CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加， 24小時達到最高 ，之后轉化率再下降（這是由于總的活菌數隨時間延長而減少造成的）； 4 ．化合物及無機離子的影響：在 Ca2+的基礎上聯(lián)合其他二價金屬離子（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高（ 1001000倍）； 5 ．所使用的器皿必須 干凈 。跡量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率； 6 ．質粒的大小及構型的影響：用于轉化的應主要是 超螺旋的 DNA； 7 ．一定范圍內，轉化效率與外源 DNA的濃度呈正比； 轉化（ transformation） ? 重組分子導入適宜的宿主細胞的過程就是轉化。 ? 宿主細胞也稱為 受體細胞 ，分為原核細胞和真核細胞兩類。 ? 原核細胞以大腸桿菌為主，真核細胞包括酵母及動物細胞等。 ? 在基因克隆技術中，轉化特指質粒 DNA或以它為載體構建的重組子導入宿主細胞的過程。通過宿主細胞的復制而使目的基因得到大量的擴增。 轉化的方法 ? 化學的方法 (熱擊法 )：使用化學試劑（如 CaCl2）制備的