【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 人有關(guān)腫瘤方面的健康體檢、普查，特別是對(duì)中老年人定期健康體檢，通過腫瘤蛋白蕊片、基因檢測(cè)等手段為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、 早期診斷、早期治療提供幫助，同時(shí)提供有關(guān)腫瘤最新的科學(xué)預(yù)防、治療知識(shí)：腫瘤醫(yī)院在重視醫(yī)療質(zhì)量的同時(shí)，特別重視人才培養(yǎng)和科研工作，每年都有計(jì)劃地把年輕業(yè)務(wù)骨干送到國(guó)內(nèi)外知名醫(yī)院進(jìn)修學(xué)習(xí)。在省內(nèi)率先開展同種異體骨移植及異體半關(guān)節(jié)移植手術(shù)、乳腺癌改良根治同期腹直肌肌皮瓣乳房重建、開展冷循環(huán)超能射頻治療腫瘤、腹腔鏡下直腸癌根治術(shù)、立體定向適形放射治療獲得成功，并建立了云南省第一個(gè)大型超低溫冷凍骨庫(kù)；開展自體外周血造血干細(xì)胞移植支持大劑量化療。承擔(dān)著昆明醫(yī)學(xué)院研究生、本科生、大專生的教學(xué)任務(wù)。2006年開展了局部晚期肺癌擴(kuò)大手術(shù)、肺癌侵犯上腔靜脈，左心房行上腔靜脈置換、左心房部分切除、肺葉切除手術(shù)等多項(xiàng)新技術(shù)研究；同時(shí)承擔(dān)了昆明醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新群體基金等基金項(xiàng)目；編寫腫瘤學(xué)系列教材5部，其中《臨床腫瘤外科學(xué)》、《臨床腫瘤內(nèi)科學(xué)》已于2006年11月由云南省科技出版社正式出版。2006年繼續(xù)承擔(dān)昆明醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)專業(yè)本科生、夜大生、高職生的教學(xué)任務(wù)和護(hù)理專業(yè)部份學(xué)生的臨床實(shí)習(xí)工作。藥學(xué)專業(yè)臨床課程的本科教學(xué)和成教學(xué)院的授課任務(wù)，醫(yī)學(xué)影像、檢驗(yàn)、麻醉、護(hù)理專業(yè)的部分課程。目前，云南省腫瘤醫(yī)院有學(xué)科帶頭人3人，有105人具有高級(jí)職稱；有博士2人，碩士29人（還有在讀博士生4人，在讀碩士78人）。已招收研究生40名。 2005年計(jì)劃招收研究生 23名。2006年還成功舉辦了云南省第二屆腫瘤規(guī)范化診治培訓(xùn)班。經(jīng)過十二年的建設(shè)發(fā)展，醫(yī)院現(xiàn)已建設(shè)成為集醫(yī)療、教學(xué)、科研為一體的初具規(guī)模在省內(nèi)有一定知名度的省級(jí)腫瘤?？漆t(yī)院。二、 所需技術(shù)的主要內(nèi)容（一）背景原發(fā)性腦腫瘤的年發(fā)病率為219/10萬(wàn)人，約60％為膠質(zhì)細(xì)胞瘤，其中大多數(shù)為高度惡性的星形細(xì)胞瘤。目前，惡性腦腫瘤是導(dǎo)致死亡的主要癌癥之一。%，腦腫瘤在因癌癥死亡的15歲以下兒童及 1534歲的人群中是第二位最常見原因，在腫瘤死亡的3554歲的女性人中是第四位最常見原因。膠質(zhì)瘤特別是膠母細(xì)胞瘤，發(fā)病年齡多在壯年，對(duì)社會(huì)、家庭都是很大的打擊。因此，如何提高對(duì)惡性腦腫瘤特別是膠質(zhì)瘤的治療效果，具有重大臨床和社會(huì)意義。由于膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)特性，加上解剖位置的特殊性，盡管手術(shù)和放療仍難免復(fù)發(fā)?；煂?duì)消滅手術(shù)后殘留腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤復(fù)發(fā)起十分重要的作用。然而，目前化療的臨床有效率低，除血腦屏障限制藥物進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)外，腫瘤細(xì)胞本身對(duì)抗癌藥物耐藥及個(gè)體化治療的缺乏是影響化療效果的重要原因。本項(xiàng)目，通過對(duì)核甘酸切除修復(fù)（NER）系統(tǒng)從酶活性到遺傳學(xué)的深入研究，探討膠質(zhì)瘤新的耐藥分子機(jī)制，將為克服耐藥提供新的靶點(diǎn)，具有重大理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本項(xiàng)目的臨床研究：檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)（MGMT、Pgp、MRP、LRP、TOPOⅡ等）以及體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)膠質(zhì)瘤個(gè)體化化療，不僅可以提高膠質(zhì)瘤臨床治療效果，而且還將為膠質(zhì)瘤臨床規(guī)范化的化療提供具體方案。具有推廣應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)深入揭示膠質(zhì)瘤耐藥分子機(jī)制，從而克服耐藥，提高膠質(zhì)瘤的治療效果，具有重大意義和實(shí)用價(jià)值。（二）主要技術(shù)難題 NER是一個(gè)十分復(fù)雜的DNA修復(fù)系統(tǒng)，至少有20個(gè)基因的產(chǎn)物參與其全過程。NER功能異常易導(dǎo)致細(xì)胞癌變，但若腫瘤細(xì)胞具有完善的NER系統(tǒng)，就可能會(huì)通過對(duì)化療所至的DNA損傷修復(fù)而導(dǎo)致耐藥。己有研究發(fā)現(xiàn)一些參與NER的基因（ERCC1－6）表達(dá)與腫瘤耐藥相關(guān)。在針對(duì)NER系統(tǒng)中的重要因子ERCCERCCERCC3和XPA在14株人腫瘤細(xì)胞的表達(dá)和BCNU耐藥性研究方面，我們發(fā)現(xiàn)ERCC2的表達(dá)與腫瘤對(duì)BCNU耐藥呈顯著相關(guān)（15）。在檢測(cè)了美國(guó)NCI用于抗癌藥篩選的60株人腫瘤細(xì)胞的NER基因表達(dá)并與170種抗癌藥敏感性比較后發(fā)現(xiàn)，ERCC2蛋白水平與甲基化類抗癌藥耐藥性正相關(guān)（16）。將ERCC2基因轉(zhuǎn)入人腦膠質(zhì)瘤SKMG4轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證明了這一結(jié)果（17），其對(duì)甲基化類抗癌藥的耐受性明顯增加。問題是：NER系統(tǒng)中的一些因子與耐藥相關(guān)，是否說明NER參與了耐藥過程？也就是NER功能與那些因子（具體的EBCC1－6）表達(dá)是否一致？Vogel等最近的研究提示，ERCC2在NER系統(tǒng)中并不是限速酶，而ERCC1蛋白水平則與NER活性直接相關(guān)。此外，參與NER過程的那些因子是否可能通過NER以外的途徑導(dǎo)致耐藥？ERCC基因?yàn)橹袊?guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）NER缺陷的基因，其中ERCC2和ERCC3是解螺旋酶，對(duì)損傷段DNA解螺旋。ERCC2還是轉(zhuǎn)錄因子ⅡH（transcription factor IIH，TFllH）中的主要成分之一。Sitaram等最近發(fā)現(xiàn)在修復(fù)由亞硝脲所至的DNA損傷過程中（從轉(zhuǎn)錄股DNA上清除乙酸嘌呤），需要有ERCC2的參與。晚近的研究提示，NER過程中需要p53參與，而p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也需要NER中的成分，如ERCC2和ERCC3的參與。因此， NER和細(xì)胞凋亡之間有著密切的聯(lián)系。我們對(duì)CENU耐藥性與p53表達(dá)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)與ERCC2一樣，p53的表達(dá)與人腦腫瘤細(xì)胞對(duì)CENU耐藥相關(guān)。更有意思的是，當(dāng)將 ERCC2和p53二個(gè)因素綜合考慮時(shí)，他們與CENU耐藥性間的相關(guān)性更加顯著。提示，ERCC2和p53在腫瘤細(xì)胞對(duì)CENU耐藥中可能有協(xié)調(diào)作用。現(xiàn)在己知，p53的活化是 DNA依賴性蛋白磷酸激酶（DNA－PK）催化的磷酸化。所以，DNA－PK通過對(duì) p53的調(diào)節(jié)，很可能會(huì)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性?，F(xiàn)有的知識(shí)提示，DNAPK，p53和NER三者間存在密切的功能聯(lián)系，然而它們是如何相互影響，以及在腫瘤耐藥過程中的確切機(jī)制還遠(yuǎn)不清楚。在研究NER表達(dá)情況時(shí)，我們沒有針對(duì)影響NER表達(dá)的基因組調(diào)控區(qū)進(jìn)行研究，也沒有對(duì)基因組本身的遺傳學(xué)改變?nèi)缍鄳B(tài)性等進(jìn)行研究，由于目前已知DNA修復(fù)基因MGMT甲基化在腦膠質(zhì)瘤化療中的起著重要作用，但腦腫瘤中NER相關(guān)基因調(diào)控區(qū)的情況未見詳細(xì)明確報(bào)道，對(duì)于NER相關(guān)基因調(diào)控區(qū)和基因組遺傳學(xué)改變對(duì)下游基因表達(dá)的影響及由此導(dǎo)致的化療耐受的影響也不清楚。 所以，我們擬檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞與臨床標(biāo)本中NER活性, 研究NER相關(guān)基因的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變及下游mRNA和蛋白的表達(dá)情況，探討NER活性與mRNA和蛋白的改變是否同遺傳學(xué)和（或）表觀遺傳學(xué)改變直接相關(guān)，并分析NER活性與膠質(zhì)瘤體藥敏試驗(yàn)結(jié)果以及臨床化療效果間的關(guān)系。探討膠質(zhì)瘤耐藥的分子機(jī)制，有望從NER系統(tǒng)找出一個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵性因子，作為有效的靶點(diǎn)，進(jìn)行化療增敏。（三）主要的技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處在于揭示膠質(zhì)瘤耐藥分子機(jī)制；從分子水平對(duì)個(gè)體化化療進(jìn)行研究，對(duì)耐藥相關(guān)基因表達(dá)與體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果和臨床化療效果進(jìn)行相關(guān)性分析，并與歷史的膠質(zhì)瘤臨床化療效果比較，歸納總結(jié)、制定膠質(zhì)瘤個(gè)體化化療規(guī)范。制定膠質(zhì)瘤個(gè)體化化療規(guī)范，指導(dǎo)膠質(zhì)瘤的化療，提高對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果，延長(zhǎng)患者生存期。發(fā)表學(xué)術(shù)論文至少8篇，在國(guó)內(nèi)核心雜志上發(fā)表3篇。培養(yǎng)研究生12名。（四）能提供的基礎(chǔ)條件在技術(shù)方面，課題組主要成員已建立和（或）掌握相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)并在相關(guān)領(lǐng)域工作多年，理論知識(shí)豐富，操作熟練。已經(jīng)建立了成熟的原代膠質(zhì)瘤藥敏試驗(yàn)，免疫組化測(cè)定耐藥相關(guān)基因Pgp、MRP、LRP、MGMT的表達(dá)。熒光定量RTPCR技術(shù)、Western blot, DNAPK 活性測(cè)定等分子生物學(xué)技術(shù)。在人員方面，本課題由臨床和實(shí)驗(yàn)室二方面人員。在實(shí)驗(yàn)條件方面，云南省腫瘤醫(yī)院昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院是云南最大的，最權(quán)威的腫瘤專科醫(yī)院，能保證本課題所需的病例來源。云南省腫瘤醫(yī)院的腫瘤研究所，已具備完成本研究計(jì)劃的基本設(shè)備。耐藥的淋巴瘤細(xì)胞株的構(gòu)建一、云南省腫瘤醫(yī)院2006年基本情況云南省腫瘤醫(yī)院（昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院），建于80年代中期，是我省第一家集醫(yī)療、教學(xué)、科研為一體的以腫瘤治療為主的綜合性醫(yī)院醫(yī)院編制病床700張，職工776人，副高以上人員135人，研究生導(dǎo)師13人，技術(shù)力量雄厚。薈萃了省內(nèi)外許多有志獻(xiàn)身腫瘤事業(yè)、具有較高學(xué)術(shù)造詣和豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的專家。許多教授、主任醫(yī)師是云南省、昆明醫(yī)學(xué)院的醫(yī)療、教學(xué)、科研的學(xué)科帶頭人。對(duì)于腫瘤病人，采取科學(xué)合理、規(guī)范的綜合治療，在外科手術(shù)、內(nèi)科化療、放射治療、生物及免疫治療和中西醫(yī)結(jié)合治療上均能為病員提供高質(zhì)量的服務(wù)，腫瘤診療技術(shù)處于云南省的領(lǐng)先水平。開展正常人有關(guān)腫瘤方面的健康體檢、普查，特別是對(duì)中老年人定期健康體檢，通過腫瘤蛋白蕊片、基因檢測(cè)等手段為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療提供幫助，同時(shí)提供有關(guān)腫瘤最新的科學(xué)預(yù)防、治療知識(shí)醫(yī)院編制病床700張，職工776人，副高以上人員135人，研究生導(dǎo)師13人，技術(shù)力量雄厚。薈萃了省內(nèi)外許多有志獻(xiàn)身腫瘤事業(yè)、具有較高學(xué)術(shù)造詣和豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的專家。許多教授、主任醫(yī)師是云南省、昆明醫(yī)學(xué)院的醫(yī)療、教學(xué)、科研的學(xué)科帶頭人。為滿足全省各類腫瘤患者及其它各種疾病病人的診治需求，我院現(xiàn)已開設(shè)16個(gè)臨床科室、8個(gè)醫(yī)技科室、1個(gè)研究所（腫瘤研究所）、3個(gè)省級(jí)研究中心（大腸癌研究中心、放射治療研究中心、腫瘤化療研究中心）。 對(duì)于腫瘤病人，采取科學(xué)合理、規(guī)范的綜合治療，在外科手術(shù)、內(nèi)科化療、放射治療、生物及免疫治療和中西醫(yī)結(jié)合治療上均能為病員提供高質(zhì)量的服務(wù)，腫瘤診療技術(shù)處于云南省的領(lǐng)先水平。開展正常人有關(guān)腫瘤方面的健康體檢、普查，特別是對(duì)中老年人定期健康體檢，通過腫瘤蛋白蕊片、基因檢測(cè)等手段為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、 早期診斷、早期治療提供幫助，同時(shí)提供有關(guān)腫瘤最新的科學(xué)預(yù)防、治療知識(shí)：腫瘤醫(yī)院在重視醫(yī)療質(zhì)量的同時(shí)，特別重視人才培養(yǎng)和科研工作，每年都有計(jì)劃地把年輕業(yè)務(wù)骨干送到國(guó)內(nèi)外知名醫(yī)院進(jìn)修學(xué)習(xí)。在省內(nèi)率先開展同種異體骨移植及異體半關(guān)節(jié)移植手術(shù)、乳腺癌改良根治同期腹直肌肌皮瓣乳房重建、開展冷循環(huán)超能射頻治療腫瘤、腹腔鏡下直腸癌根治術(shù)、立體定向適形放射治療獲得成功，并建立了云南省第一個(gè)大型超低溫冷凍骨庫(kù)；開展自體外周血造血干細(xì)胞移植支持大劑量化療。承擔(dān)著昆明醫(yī)學(xué)院研究生、本科生、大專生的教學(xué)任務(wù)。2006年開展了局部晚期肺癌擴(kuò)大手術(shù)、肺癌侵犯上腔靜脈，左心房行上腔靜脈置換、左心房部分切除、肺葉切除手術(shù)等多項(xiàng)新技術(shù)研究；同時(shí)承擔(dān)了昆明醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新群體基金等基金項(xiàng)目；編寫腫瘤學(xué)系列教材5部，其中《臨床腫瘤外科學(xué)》、《臨床腫瘤內(nèi)科學(xué)》已于2006年11月由云南省科技出版社正式出版。2006年繼續(xù)承擔(dān)昆明醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)專業(yè)本科生、夜大生、高職生的教學(xué)任務(wù)和護(hù)理專業(yè)部份學(xué)生的臨床實(shí)習(xí)工作。藥學(xué)專業(yè)臨床課程的本科教學(xué)和成教學(xué)院的授課任務(wù)，醫(yī)學(xué)影像、檢驗(yàn)、麻醉、護(hù)理專業(yè)的部分課程。目前，云南省腫瘤醫(yī)院有學(xué)科帶頭人3人，有105人具有高級(jí)職稱；有博士2人，碩士29人（還有在讀博士生4人，在讀碩士78人）。已招收研究生40名。 2005年計(jì)劃招收研究生 23名。2006年還成功舉辦了云南省第二屆腫瘤規(guī)范化診治培訓(xùn)班經(jīng)過十二年的建設(shè)發(fā)展，醫(yī)院現(xiàn)已建設(shè)成為集醫(yī)療、教學(xué)、科研為一體的初具規(guī)模在省內(nèi)有一定知名度的省級(jí)腫瘤?？漆t(yī)院。二、所需技術(shù)的主要內(nèi)容（一）背景 非霍奇金淋巴瘤（NHL）是惡性淋巴瘤的一種，是常見的原發(fā)于淋巴組織的惡性腫瘤，全世界近二十年來其發(fā)病率每年以3％－5％的比率穩(wěn)定上升。‰，每年新發(fā)病例２．５萬(wàn)人，死亡２萬(wàn)人。 盡管目前淋巴瘤的治療藥物和方案種類繁多，但其治療效果并不十分令人滿意。原因一方面是對(duì)復(fù)發(fā)或難治的惡性淋巴瘤，現(xiàn)有的聯(lián)合化療（以經(jīng)典CHOP方為代表）無法顯著提高緩解率和患者的長(zhǎng)期無病生存率；另一方面，反復(fù)多次化療后腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多藥耐藥使化療難度進(jìn)一步加大。因此，目前各國(guó)研究者正著力于從不同角度研制和開發(fā)新的抗淋巴瘤藥物。其中有關(guān)腫瘤細(xì)胞的凋亡是研究熱點(diǎn)之一。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是具有特殊形態(tài)學(xué)和生化改變的并由基因控制的生理性或病理性細(xì)胞死亡方式，在正常的胚胎發(fā)育、組織分化、個(gè)體生長(zhǎng)、衰老過程，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面都起著重要作用[2]。傳統(tǒng)的腫瘤治療觀念是化療藥物直接作用于核酸、微管蛋白和其他靶點(diǎn)來殺傷腫瘤細(xì)胞，隨著凋亡研究的逐步深入，這種觀點(diǎn)不斷被補(bǔ)充和修正。人們認(rèn)識(shí)到化療藥物除通過同各自的靶點(diǎn)直接作用外，也可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來殺傷腫瘤細(xì)胞。目前有許多體外實(shí)驗(yàn)研究證明，化療藥物是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)腫瘤的治療作用[3]。而實(shí)際上許多對(duì)凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)也是通過化療藥物誘導(dǎo)凋亡來證實(shí)。細(xì)胞凋亡已成為衡量腫瘤化療效應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)。吉西他濱（Gemcitabine）是20世紀(jì)90年代開發(fā)的一種新型的脫氧胞苷抗腫瘤藥，其作用機(jī)制非常復(fù)雜，已被廣泛應(yīng)用于肺癌、胰腺癌的治療。近年來有人嘗試將其應(yīng)用于復(fù)發(fā)和難治性淋巴瘤的臨床治療并取得一定的療效。吉西他濱已被證實(shí)具有誘導(dǎo)多種實(shí)體瘤細(xì)胞（非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、胃癌等）發(fā)生凋亡的作用 ，而關(guān)于吉西他濱誘導(dǎo)人復(fù)發(fā)和難治性非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡的作用的基礎(chǔ)研究鮮有報(bào)道。因此擬行“吉西他濱對(duì)復(fù)發(fā)和難治性Raji細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究”以探討吉西他濱抗淋巴瘤的可能作用機(jī)制，為吉西他濱用于難治性和復(fù)發(fā)性非霍奇金淋巴瘤的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，指導(dǎo)臨床治療。（二）主要技術(shù)難題耐藥的淋巴瘤細(xì)胞株的構(gòu)建。包括“上海晶美”，“北京中衫金橋”等代銷國(guó)內(nèi)外生物產(chǎn)品的大型生物試劑公司有耐藥的肺癌，舌癌等腫瘤株的生物產(chǎn)品；針對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株，卻只有普通的B系，T系淋巴瘤細(xì)胞株，沒有耐藥的細(xì)胞株產(chǎn)品供科研需要。相應(yīng)的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)也沒有明確指導(dǎo)培育供科研實(shí)驗(yàn)的耐藥的淋巴瘤細(xì)胞株的說明。我院也正在實(shí)踐摸索中，因此，該技術(shù)亟待相關(guān)部門給予技術(shù)，人才等方面的支持。（三）擬達(dá)到的主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究以探求抗耐藥淋巴瘤的新的化療藥，為難治性和復(fù)發(fā)性非霍奇金淋巴瘤的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，指導(dǎo)臨床治療；為盡早克服難治性和復(fù)發(fā)性非霍奇金淋巴瘤帶來希望。（四）云南省腫瘤醫(yī)院能為該技術(shù)的順利實(shí)施所提供的條件研究人員來自腫瘤專科醫(yī)院的腫瘤臨床和科研部門，各自具有一定的臨床和科研能力能互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，團(tuán)結(jié)努力的完成