【文章內(nèi)容簡介】 學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? SiRNA [small interfering RNA ] ? Dicer [dsRNA specific endonuclease] ? RISC [RNAinduced silencing plex] ? Silencer ? RdRp [RNAdependent RNA polymerase] 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 Science 2022 296:1263 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 RNAi的作用特征 RNAi是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 。 RNAi 具有高度的特異性 —— dsRNA能夠非常特異地誘導(dǎo)與之序列同源的的 mRNA降解 ， 而無關(guān)基因不受影響 。 RNAi 具有高效性 —— 極低濃度的 dsRNA就能完全抑制基因表達(dá) 。 相對很少量的 dsRNA分子 （ 數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源 mRNA的數(shù)量 ） 就能產(chǎn)生強烈的 RNAi效應(yīng) ， 產(chǎn)生類似基因 “ 剔除 ” 的效果 。 4 、 RNAi 存在放大效應(yīng) 。 通過線蟲 、 果蠅和小鼠的實驗研究發(fā)現(xiàn) ， 少量的 dsRNA 能夠使大量的靶基因沉默 ， 即便細(xì)胞增殖 50100倍仍可保持 RNAi 效應(yīng) ， 這表明 RNAi 存在擴增機制 。 RNAi 作用廣泛并可遺傳 —— dsRNA抑制效應(yīng)具有傳遞的特性 。dsRNA介導(dǎo) RNAi不僅在導(dǎo)入部位產(chǎn)生抑制效應(yīng) ， 而且可以跨越細(xì)胞界限在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持 。 在線蟲 ， 果蠅等 RNAi 效應(yīng)可以在生物體內(nèi)傳播 ， 并可傳給子代 。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 RNAi的研究方法與途徑 A：直接轉(zhuǎn)染 1 現(xiàn)成的 SiRNA Qiagen Ambion 2 化學(xué)合成 SiRNA 3 體外轉(zhuǎn)錄自行制備 4 消化長片斷 dsRNA 5 PCR擴增制備 SiRNA B：間接轉(zhuǎn)染 1 構(gòu)建特定的 SiRNA載體 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 RNAi的研究現(xiàn)狀及用途 ? 對于后基因組時代大量已測序的未知基因： ? 高通量研究基因功能 ? 對于復(fù)雜信號傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系： ? 研究信號通路的新工具（聯(lián)合傳統(tǒng)的突變?nèi)笔Ъ夹g(shù)） ? 對于病毒感染和擁有復(fù)雜調(diào)控體系的腫瘤： ? 基因治療的新方法（ HIV 、 HCV） 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 RNAi具有高度特異性、高效性和穩(wěn)定性等特點 應(yīng)用舉例： ? 在 2022年， Gheysen G和 Vanholme B首次系統(tǒng)闡述了利用植物寄主向線蟲傳遞 RNAi的可能性；在 2022年， Fairbairn DJ等正式提出HDRNAi（ hostdelivered RNA interference）技術(shù)，并認(rèn)為 HDRNAi技術(shù)是一種實現(xiàn)線蟲基因沉默的有效策略 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生線蟲目標(biāo)基因的 雙 鏈 RNA(dsRNA) (a)→dsRNA 被植物 DICER酶 (b)酶切 → 形成小干涉RNA(siRNAs) (c)→ 當(dāng)線蟲從植物細(xì)胞取食位點 (d)取食時 ，siRNA(e)被線蟲吸收 （ 若有較長的 dsRNA被線蟲吸收 ， 則dsRNA可被線蟲 DICER酶酶切 ，進(jìn)一步形成 siRNA） → 線蟲吸收的 siRNA被線蟲 RISC復(fù)合物識別 ， 帶有反義鏈的 RISC復(fù)合物與線蟲對應(yīng)的 mRNA相互作用 (f)→mRNA 被 切 割(g)→mRNA 被進(jìn)一步降解 (h) 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 2022年 Huang G等首次研究報道，通過對南方根結(jié)線蟲 16D10基因進(jìn)行 RNAi，提高了擬南芥對線蟲的抗性 。 ? 同年， Yadav BC等報道通過寄主傳遞 RNAi分子，對南方根結(jié)線蟲編碼剪切因子（ splicing factor）基因和整合酶（ integrase）基因進(jìn)行RNAi，減少了煙草根結(jié)的形成 。 ? 2022年 Fairbairn DJ等報道利用 HDRNAi技術(shù)，對爪哇根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)錄因子 MjTis11基因進(jìn)行 RNAi，通過煙草傳遞 RNAi分子，穩(wěn)定沉默了取食轉(zhuǎn)基因煙草的線蟲相關(guān)基因。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 2022年 Baum JA等報道，利用玉米傳遞 RNAi分子，對屬于鞘翅目的昆蟲西方玉米根蟲 (western corn rootworm) β tubulin、 VATPase A酶、 VATPase E酶基因進(jìn)行 RNAi，不同程度提高了玉米的抗 性。 ? 2022年 Mao YB等報道對棉鈴蟲 CYP6AE14酶基因進(jìn)行RNAi（ Mao YB等將 hostdelivered RNAi稱為 plantmediated RNAi），提高了轉(zhuǎn)基因棉花的 抗性。 ? 2022年 Sindhu AS等報道利用 HDRNAi技術(shù)（ Sindhu AS等將 hostdelivered RNAi稱為 hostinduced RNAi），對胞囊線蟲（ cyst nematode） 4個編號為 10A04G0 8H0 3B05基因進(jìn)行 RNAi，結(jié)果轉(zhuǎn)基因擬南芥中線蟲降低了 2364% 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 參考文獻(xiàn) ? Plant Cell, 1990,2:279 ? Plant Mol Biol 1996,31:957 ? Cell 1995,81:611 ? Nature 1998 381:806 ? Curr Opin Geics 2022 12:225 ? Nature 2022 107:309 ? Cell 2022 107:309 ? Cell 2022 107:297 ? Cell 1999 99:133 ? Science 2022 296(5567):550 ? PNAS 2022 99(6):5515 ? Nat Rev Ge 2022,3:737 ? J Cell Science 2022,114(224)4457 ? Nature Biotechnol 2022,19:497 ? Nature Biotechnol 2022,19:500 ? Nature 2022,418:38 ? Biochem Biophys Res Commun 2022,281(3):639 ? Oncogene 2022,21(37):5716 ?Eur J Biochem 2022 269(8):2151 ?Nature Geics 2022 24(2):180 ?EMBO J 2022,21 (17):4419 ?J Cell Biol 2022 158(4):639 ?Biochem Biophys Res Commun, 2022,287(5):1099 ?Nature Rev Gen 2022,2:110 ?Genes Dev 2022,10:638 ?生物學(xué)通報 2022， 37（ 3） :15 ?生物技術(shù)通訊 2022 15（ 3） :285 ?醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志 2022， 2（ 1） : 23 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 167。 11 基因組 167。 遺傳的分子基礎(chǔ) 1) 二級結(jié)構(gòu)是建筑蛋白質(zhì)的基石 。 2) 蛋白質(zhì)基序或模體 (motif) 是蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu) 。 3) 蛋白質(zhì)域賦予了蛋白質(zhì)家族的特征 . 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 1) α 螺旋 2)β 折疊 3) 轉(zhuǎn)角 (turn) 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 蛋白質(zhì)基序 在許多蛋白質(zhì)中都可發(fā)現(xiàn)由 2個或 3個二級結(jié)構(gòu)如 α 螺旋， β 折疊和轉(zhuǎn)環(huán)構(gòu)成的組合，它們有特征性的序列，具有特 定的功能，稱為基序或模體（ motif）。鋅指結(jié)構(gòu)（ zinc finger）即是一種十分常見的蛋白質(zhì)基序。鋅指基序含３ 個二級結(jié)構(gòu)：一個 α 螺旋，一對反向平行的 β 鏈。在鋅指 基部２個位于 α 螺旋的組氨酸和２個位于 β 鏈的半胱氨酸 與鋅指中的金屬離子（鋅）螯合，形成 “ 指狀 ” 結(jié)構(gòu)。指狀 結(jié)構(gòu)可與 DNA螺旋的大溝結(jié)合，與大約５個核苷酸相互作 用，起到識別順序的功能。螺旋 環(huán) 螺旋 (helixloop helix) 也是一種蛋白質(zhì)基序，是許多鈣結(jié)合蛋白質(zhì)