【文章內(nèi)容簡介】 發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn)復(fù)合微生物制劑 生物肥藥。建立以利用農(nóng)業(yè)防治、生物肥藥等綜合防控技術(shù)及枯萎病綜合治理標準操作規(guī)程。建立了以利用農(nóng)業(yè)防治、生物 10 肥藥等綜合防控技術(shù)進行茄科與瓜類蔬菜主要土傳病害的生物防治，累計推廣 20 多萬畝次，對不同茄科與瓜類蔬菜主要土傳病害防效達 7590%，累計增收 8000 萬元。鑒定專家組一致認為，本項目總體上達到國際領(lǐng)先水平。 4）獲農(nóng)藥登記證 5 項，獲得研究成果 4 項，申請國家專利 15 項，其中授權(quán) 9 項，出版著作 2 本，發(fā)表論文 112 篇，完成研究報告 500 多篇，培 養(yǎng)博士 2 名，研究生 20 名。 11 4．創(chuàng)新點及創(chuàng)新程度： （ 1）青枯生防菌 ANTI8098A 的篩選和培養(yǎng) 采用目標病原菌多重菌株平行測定法從我省福州、莆田、三明、龍巖、寧德、南平、廈門、漳州、泉洲茄科作物根系土壤中分離的微生物菌種中，篩選出 對 青枯生防菌 ANTI8098 菌株（ Bacillus cereus ANTI8098），對青枯病原菌有良好的抑制作用，經(jīng)德國微生物菌種保存定名為 ANTI8098A，并進行了該菌的微生物學(xué)研究和培養(yǎng)基配方的篩選，使發(fā)酵水平達到每毫升 40 億芽孢以上，為工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。 （ 2）青枯生防菌致弱機理的提出 抑菌機理可以分為：拮抗、抗生、誘導(dǎo)、競爭等幾種，本研究首次發(fā)現(xiàn)了青枯病生防菌的致弱現(xiàn)象，即生防菌 ANTI8098A 使用后，使得青枯菌的強致病力菌株轉(zhuǎn)化為無致病力菌株，使青枯病的發(fā)生受到抑制。并通過病理學(xué)、微生態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方法，對生防菌的致弱機理進行了研究，提出了 PCR 電泳、紫外分光、液相色譜、異源吸附蛋白、 TTC 培養(yǎng)基測定、寄主植物回接、增長率測定 等一套致弱作用的檢測方法。本研究提出一種科學(xué)假說，抑菌機理的致弱原理，即由微生物產(chǎn)生的中間產(chǎn)物的作用，使強致病力菌株的菌株轉(zhuǎn)化為無致病力菌株的菌株，使無致病力菌株發(fā)展成為微生物環(huán)境的優(yōu)勢菌體，達到抑制病害的作用。經(jīng)國內(nèi)外文獻檢索未見生防菌對青枯病原菌致弱作用的報道，致弱原理的提出，補充了抑菌機理，建立了新的抑菌機理的原理和方法，為青枯病生物防治機理的研究提供了新思路。同時對于病害弱株系的應(yīng)用，可能找到了一條新途徑。 （ 3）青枯生防菌 ANTI8098A 抑菌物質(zhì)的分離 通過對生防菌 ANTI8098A 發(fā)酵液進行離心、蛋白質(zhì)分析、分子篩分離，耐熱反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)生防菌 ANTI8098A 的抑菌物質(zhì)是一種非蛋白質(zhì)的耐熱毒素，不同分子量的 ANTI8098的發(fā)酵產(chǎn)物對青枯病原菌有不同的抑制作用。生防菌在小分子量范圍（ 1000 道爾頓）聚集了多糖類耐熱抗菌物質(zhì)，在大分子量范圍（ 20200 道爾頓）聚集了蛋白質(zhì)類的抗菌物質(zhì)的增效因子。 （ 4）青枯生防菌 ANTI8098A 的發(fā)酵技術(shù) 生防菌 ANTI8098A 生產(chǎn)是利用生物反應(yīng)器進行發(fā)酵。最初的細菌發(fā)酵的靠人工控制，進而使用儀表控制，發(fā)展到用計算機控制。本研究提出了 網(wǎng)絡(luò)監(jiān)控生物反應(yīng)器的研究，并自行設(shè)計了生物反應(yīng)器計算機控制軟件和硬件，網(wǎng)絡(luò)監(jiān)控軟件，實現(xiàn)了生物反應(yīng)器的網(wǎng)絡(luò)監(jiān)遠程控技術(shù)。網(wǎng)絡(luò)監(jiān)控生物反應(yīng)器實體模型由生物反應(yīng)器、傳感器和執(zhí)行機構(gòu)、計算機控制系統(tǒng)、網(wǎng)絡(luò)遠程監(jiān)控技術(shù)組成。整個系統(tǒng)將現(xiàn)場發(fā)酵的條件和圖象上網(wǎng)，實現(xiàn)生物反應(yīng)器運行過程的遠程網(wǎng)絡(luò)控制。經(jīng)國內(nèi)外文獻檢索未見網(wǎng)絡(luò)遠程實時監(jiān)控技術(shù)在青枯菌生防菌發(fā)酵過程應(yīng)用的報道。本研究對生防菌 ANTI8098A 發(fā)酵過程培養(yǎng)基上罐實消的參數(shù)變化進行了研究，提出一套實消過程的參數(shù)模型，為網(wǎng)絡(luò)控制生物反應(yīng)器的設(shè)計提供模擬參數(shù)。 12 （ 5）青枯生防菌 ANTI8098 的制劑技術(shù) 在研制防治青枯病的微生物農(nóng)藥時，存在的主要問題是微生物農(nóng)藥中菌的保存和使用時菌在土壤中的定殖問題。作為生物農(nóng)藥，要求菌的保存期應(yīng)達 24 個月以上，制劑中的菌存活力的控制十分關(guān)鍵。由于土壤本身具有天然的生物緩沖作用，青枯生防菌施用于土壤時，菌體大量死亡或菌量迅速減少，土壤微生物菌系的競爭無法定殖，這是生防菌防治效果不穩(wěn)定的重要原因之一。為了提高生防菌在制劑中的存活率，減緩在土壤中的死亡率，提高在土壤中定殖水平，本試驗對生防菌 ANTI8098A 的存活基質(zhì)進行 了研究，篩選所得的存活基質(zhì)（ Survival Material），提高了生防菌在基質(zhì)保存中的存活率，延緩了其在土壤中的衰亡時間，將篩選出的優(yōu)良基質(zhì)通過混合、干燥、制粒、包裝，即成為生物殺菌劑（商品名：安地 ANIT），多年的試驗表明茄科青枯病具有良好的防效。 （ 6）青枯生防菌劑 ANTI8098A 的生物測定技術(shù) 青枯菌的生物防治，受到環(huán)境因素影響很大，如溫濕的影響作用可以超過生防菌本身的防治效果，如果沒有一致的無病蟲苗、穩(wěn)定的溫濕度控制、良好的光照條件，生防菌的生物測定是難以進行。本研究設(shè)計的水層隔熱 式控濕網(wǎng)室由鋁合金結(jié)構(gòu)、頂部水槽、防蟲網(wǎng)、控濕系統(tǒng)、雙層隔離門組成，為寄主植物苗的培育提供良好的光照、通風(fēng)、隔熱、濕度、嚴格的害蟲隔離條件，解決用于生防菌生物測定的無病蟲植物苗的培育。光波溫室由控溫系統(tǒng)、控濕系統(tǒng)、滴灌系統(tǒng)、光波調(diào)節(jié)系統(tǒng)組成，為生防菌生物測定過程提供標準穩(wěn)定的植物正常生長的環(huán)境，提高生物測定的精 度。視頻監(jiān)視人工氣候箱由箱體，光照系統(tǒng)、溫度系統(tǒng)、濕度系統(tǒng)、視頻監(jiān)控系統(tǒng)組成，為進行溫度對生防菌防治青枯病的影響提供條件。同時實現(xiàn)遠程監(jiān)視和自動記錄。三個設(shè)備的設(shè)計，為生防菌生物測定提供穩(wěn)定的環(huán)境條件，提高生物測定的精確度。 （ 7）青枯生防菌劑 ANTI8098A 的毒性 項目組已完成了生防菌劑 ANTI8098A（安地）農(nóng)業(yè)部規(guī)定毒性檢測，包括 1）大鼠急性經(jīng)口毒性試驗， 2）大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗， 3）大鼠急性吸入毒性試驗， 4）家兔急性皮膚刺激試驗， 5）家兔眼刺激試驗， 6）豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)（致敏）試驗。 檢測結(jié)果表明，生防菌劑 ANTI8098A（安地）屬微毒性農(nóng)藥，對皮膚和眼無任何刺激作用。 （ 8）采用營養(yǎng)親和群、脂肪酸等方法系統(tǒng)分析了不同茄科與瓜類寄主來源的尖孢鐮刀菌種下分化特征，建立了尖孢鐮刀菌寄主專化型脂肪酸判別模型 通過 茄科與瓜類蔬菜 枯萎病害調(diào)查，首次分析了枯萎病的空間蔓延規(guī)律，并利用常規(guī)診斷及分子診斷相結(jié)合方法進行了病原菌的復(fù)合侵染研究。首次采用營養(yǎng)親和群和脂肪酸等方法系統(tǒng)分析了不同茄科與瓜類寄主來源的尖孢鐮刀菌種下分化特征，首次建立了尖孢鐮刀菌寄主?；椭舅崤袆e模型。 （ 9）尖孢鐮刀菌無毒基 因的克隆及測序 對來源于黃瓜、甜瓜、西瓜、辣椒、茄子、花生、和豇豆等寄主的 90 個尖孢鐮刀菌菌株，利用引物 ORF1/ORF2 進行 PCR 擴增目的基因 SIX1 的片段，經(jīng)測序及 BLAST 比 13 對共獲得 30 條有效序列。采用番茄鐮刀枯萎病菌 SIX1 無毒基因引物 P12F2/P12R1PCR擴增序列，通過克隆測序，驗證了菌株 FJAT9290 攜帶無毒基因（ GenBank 登錄號AJ608702），該基因為目前國內(nèi)第一個從尖孢鐮刀菌上獲得的無毒基因。 （ 10）篩選了多株茄科與瓜類枯萎病生防菌，包括短短芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、哈 茨木霉、凝結(jié)芽胞桿菌，研究其微生物學(xué)特性及其（復(fù)合）微生物發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn)復(fù)合微生物制劑 生物肥藥 篩選出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、生防效果穩(wěn)定的枯萎病生防細菌芽胞桿菌（短短芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌和凝結(jié)芽胞桿菌）和生防真菌哈茨木霉菌，研究其微生物學(xué)特性及其（復(fù)合）微生物發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn)復(fù)合微生物制劑 生物肥藥。申報專利 8 項，其中授權(quán) 4 項，獲得農(nóng)藥登記證 2 項。 （ 11）將淡紫擬青霉應(yīng)用于甘薯莖線蟲的防治，建立了高毒力培養(yǎng)數(shù)學(xué)模型 對淡紫擬青霉的研究主要用于控制根結(jié)線蟲和胞囊線蟲。本項目篩選出對多種作物根結(jié)線蟲（ Meloidogyne spp）高防效的淡紫擬青霉 NHPL2020 菌株，首次發(fā)現(xiàn)了該菌株對甘薯莖線蟲（ Ditylenchus destrutor）具有很高的毒殺效應(yīng)，明確了培養(yǎng)基營養(yǎng)、培養(yǎng)溫度、 pH 和通氣量對淡紫擬青霉 NHPL2020 殺線毒力的影響，建立了高毒力淡紫擬青霉NHPL2020 培養(yǎng)數(shù)學(xué)模型。田間試驗效果表明，淡紫擬青霉 NHPL2020 菌劑防治甘薯莖線蟲效果顯著，持效期長，與常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥比較，價格低，效果好，無藥害，無殘留，有良好的經(jīng)濟、生態(tài)、社會效益。 （ 12）明確淡紫擬青霉 NHPL2020 的殺線機理，對其幾丁質(zhì)酶基因進行了克隆 已有研究證明淡紫擬青霉分泌的幾丁質(zhì)酶對根結(jié)線蟲的卵有活性，但該菌的幾丁質(zhì)酶基因未見報道。本項目深入地研究了淡紫擬青霉 NHPL2020 的殺線機理，明確了菌株分泌幾丁質(zhì)酶是作物線蟲毒殺活性因子，首次克隆了淡紫擬青霉 NHPL2020 的幾丁質(zhì)酶基因，命名為 PLChi1，通過轉(zhuǎn)錄表達證實該基因功能是消解作物線蟲體表和卵殼的幾丁質(zhì)層主要因子。 （ 13）明確淡紫擬青霉 NHPL2020 對枯萎病菌的抑菌機理，獲得了其活性成分 國內(nèi)外已有淡紫擬青霉抑制枯萎病的報道，但未 確定其抑菌成分。本項目證實淡紫擬青霉 NHPL2020 對枯萎病病原菌 尖孢鐮刀菌有著強烈的抑菌作用，明確了其抑菌機理是菌株產(chǎn)生 β葡萄糖苷酶消解病原菌細胞壁，產(chǎn)生多糖抑制尖孢鐮刀菌的生長繁殖。首次完成了淡紫擬青霉 NHPL2020 多糖分子結(jié)構(gòu)的分析，證實了該菌株多糖為單鏈無分支的 β(13)D葡聚糖。優(yōu)化了淡紫擬青霉 NHPL2020 產(chǎn)生 β葡萄糖苷酶和多糖的培養(yǎng)條件，提高了該菌株對尖孢鐮刀菌的抑菌能力。 （ 14）證實了淡紫擬青霉 NHPL2020 對有機磷農(nóng)藥的降解效應(yīng)，明確其降解機制 現(xiàn)有研 究發(fā)現(xiàn)淡紫擬毒霉能促進難溶磷酸鹽的溶解，同類研究還表明，擬青霉還能促進許多化學(xué)聚合物（如農(nóng)藥，制革廢水等）的分解。本項目首次發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉NHPL2020 對辛硫磷農(nóng)藥有顯著的降解效應(yīng)，在防治作物線蟲和枯萎病的同時可以降解 14 農(nóng)藥殘留，明確其機制包括兩個方面：一是淡紫擬青霉菌體釋放的降解酶對有機磷的分解；二是淡紫擬青霉菌絲球?qū)τ袡C磷的吸附作用，并優(yōu)化了淡紫擬青霉最佳有機磷降解效能的發(fā)酵條件。 （ 15）創(chuàng)新生產(chǎn)工藝，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的淡紫擬青霉制劑 本項目突破了真菌深層發(fā)酵的技術(shù)難點，設(shè)計出 “一步發(fā)酵法 ”， 優(yōu)化培養(yǎng)基、發(fā)酵條件以及流加技術(shù)，創(chuàng)新菌體包被工藝，建立了生產(chǎn)技術(shù)操作規(guī)程和質(zhì)量標準，申請國家發(fā)明專利 2 項，研發(fā)出淡紫擬青霉母藥，獲得農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥登記證號 PD20206840，成為全國為數(shù)不多的淡紫擬青霉母藥生產(chǎn)單位，并以該菌劑母粉為基礎(chǔ)，開發(fā)出含 2 億活孢子 /克淡紫擬青霉粉劑，獲得農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥登記證