投送一級(jí)學(xué)科：生物學(xué)(編輯修改稿)
2025-05-01 23:28 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 目 168。 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 168。 其他項(xiàng)目 g 研究經(jīng)費(fèi) 來(lái) 源 及 數(shù) 額無(wú)項(xiàng)目的具體內(nèi)容、預(yù)期目標(biāo)及國(guó)內(nèi)外在這方面研究的現(xiàn)狀：具體內(nèi)容:在進(jìn)行小鼠不同發(fā)育階段的mRNA差異表達(dá)研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一種未報(bào)道過功能的新基因p55（分子量為55K）。我們采用原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)該基因是轉(zhuǎn)錄因子YY1調(diào)節(jié)的下游基因。由于YY1 基因敲除小鼠在圍著床期死亡，p55基因很可能在小鼠胚胎著床和蛻膜化期間發(fā)揮著重要作用。本項(xiàng)目將利用原位雜交、免疫組化、反轉(zhuǎn)錄PCR、RNA干涉等技術(shù)，詳細(xì)研究p55在小鼠早期妊娠子宮及胚胎中的表達(dá)規(guī)律，通過假孕、延遲著床及人工蛻膜化等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型確定p55在胚胎著床及蛻膜化中的作用，并采用卵巢切除模型研究激素對(duì)p55的表達(dá)調(diào)節(jié)。由于p55基因的功能到目前為止尚未見報(bào)道，本項(xiàng)目將有助于揭示p55基因的功能及其與胚胎著床的關(guān)系，為治療人類不孕癥、特異的避孕藥物提供、提高家畜的繁殖率及開發(fā)胚胎著床等重要的理論依據(jù)。預(yù)期目標(biāo)：通過小鼠假孕、延遲著床、人工蛻膜化及卵巢切除等動(dòng)物模型，采用原位雜交、免疫組化、RT－PCR、Northern Blot等實(shí)驗(yàn)方法，詳細(xì)研究p55基因在小鼠子宮及胚胎中的表達(dá)；明確p55基因在胚胎著床及蛻膜化中的作用。并利用RNAi技術(shù)進(jìn)一步研究p55基因表達(dá)對(duì)胚胎著床的影響。由于p55基因功能到目前為止尚未見報(bào)道，本研究將有助于揭示p55基因功能和進(jìn)一步了解胚胎著床的分子機(jī)制，為治療人類不孕癥、提高家畜的繁殖率及開發(fā)胚胎著床特異的避孕藥物等提供重要的理論依據(jù)。 國(guó)內(nèi)外在這方面研究的現(xiàn)狀：胚胎著床是一個(gè)涉及到子宮與胚胎間緊密對(duì)話的復(fù)雜發(fā)育過程。成功的胚胎著床需要類固醇激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和脂類介質(zhì)等分子的協(xié)同作用 (Paria et al, 2001)。利用基因芯片比較小鼠胚胎著床位點(diǎn)和非著床位點(diǎn)的差異性表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在小鼠子宮的胚胎著床點(diǎn)處有36個(gè)基因上調(diào)，27個(gè)基因下調(diào)。比較人子宮內(nèi)膜在胚胎著床窗口開放期與增殖晚期的基因表達(dá)變化，共分析了12686個(gè)基因，在胚胎著床窗口開放期有156個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)，而377個(gè)基因的表達(dá)下調(diào)(Kao et al, 2002)。然而，有意思的是，在上述有關(guān)胚胎著床的基因芯片研究中，以前已證實(shí)與胚胎著床緊密相關(guān)的許多基因，如白血病抑制因子LIF(Stewart et al, 1992)、環(huán)氧合酶2（COX2）、肝素結(jié)合樣表皮生長(zhǎng)因子（HBEGF）及肝素硫酸鹽蛋白多糖（perlecan）(Paria et al, 2002)、basigin和前列腺素E合成酶（mPGES）基因(Xiao et al, 2002。 Ni et al, 2002)，均未在這些研究中得到證實(shí)?？磥?lái)采用傳統(tǒng)的方法研究與胚胎著床相關(guān)的基因是非常有必要的。我們?cè)谶M(jìn)行小鼠不同發(fā)育階段的mRNA差異表達(dá)研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)功能未知基因，暫時(shí)命名為p55基因。通過Northern Blot發(fā)現(xiàn)p55基因在多種小鼠組織中廣泛表達(dá)。我們已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)確定了小鼠p55基因啟動(dòng)子，在其最小的上游啟動(dòng)子中存在Yin Yang 1 (YY1)的調(diào)節(jié)元件。通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）分析表明， HeLa和NIH3T3細(xì)胞核抽提物以及純化的GST－YY1蛋白均能與合成的YY1寡核苷酸探針形成DNA－蛋白質(zhì)復(fù)合物。并且，YY1區(qū)的突變導(dǎo)致p55基因啟動(dòng)子活性明顯下降（Ding et al，待發(fā)表）。YY1是一個(gè)具有多種功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。YY1 基因敲除小鼠胚胎能夠著床并發(fā)生蛻膜化，但迅速退化，在圍著床期發(fā)生死亡； YY1－/－純合子囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層缺陷，將其移入假孕YY1＋/＋小鼠子宮，胚胎不能發(fā)育到原腸胚，在圍著床期也發(fā)生死亡。這表明YY1 對(duì)于小鼠早期胚胎發(fā)育是至關(guān)重要的，推測(cè)在著床期YY1可能調(diào)控著一些小鼠胚胎細(xì)胞迅速增殖和分化所必需的基因(Donohoe et al，1999)。既然p55基因是YY1調(diào)節(jié)的基因，暗示它可能在小鼠胚胎著床期間發(fā)揮重要的作用。進(jìn)一步分析啟動(dòng)子序列還發(fā)現(xiàn)，在最小的p55基因啟動(dòng)子上游還存在一個(gè)過氧化物酶體增殖因子活化受體 （peroxisome proliferatoractivated receptors, PPAR）應(yīng)答元件。PPAR是配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子的核受體超家族成員，由三個(gè)成員，PPARα、γ和δ組成。PPARd被敲除的小鼠胚胎絕大部分不能形成正常的胎盤(Barak et al, 2002)。我們以前的研究結(jié)果顯示，PPARd在大鼠和小鼠胚胎著床及蛻膜化中具有重要作用(Ding et al，2003)。PPARd可能通過調(diào)節(jié)著床相關(guān)的基因表達(dá)而在哺乳動(dòng)物的著床過程中起重要作用。如COX2基因啟動(dòng)子中有一個(gè)PPAR應(yīng)答元件，因此PPAR可能直接調(diào)節(jié)COX2的表達(dá)。COX2缺陷小鼠不孕，具有排卵、受精、著床及蛻膜化方面的異常(Carolyn et al , 2002)。我們推測(cè)p55基因可能象COX2一樣受到PPAR的調(diào)節(jié)，在小鼠胚胎著床、蛻膜化及胎盤形成中可能具有非常重要的作用。此外，我們分析發(fā)現(xiàn)，在最小的p55基因啟動(dòng)子上游存在一個(gè)孕酮受體結(jié)合位點(diǎn)。子宮系膜側(cè)蛻膜的維持和生長(zhǎng)完全依賴于孕酮的作用，而孕酮的作用由細(xì)胞核內(nèi)的孕酮受體所介導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄(Ogle et al, 1998)。在小鼠子宮蛻膜化過程中P55基因是否受孕酮的調(diào)節(jié)還待證明。從P55基因啟動(dòng)子上的這些調(diào)節(jié)元件我們推測(cè)其可能在胚胎著床和蛻膜化過程中起作用。為了證明這個(gè)假設(shè)，我們通過Northern Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在小鼠卵巢、子宮、睪丸等組織中p55基因均有表達(dá)。，發(fā)現(xiàn)在胎盤發(fā)生中心及蛻膜區(qū)p55基因高度表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步支持了我們的假設(shè)。目前，對(duì)p55基因功能及其表達(dá)調(diào)控的研究尚未見任何報(bào)道。我們將采用研究哺乳動(dòng)物著床相關(guān)基因的常用方法，結(jié)合最近發(fā)展起來(lái)的RNA干涉(RNA interference, RNAi)技術(shù)，對(duì)p55基因在胚胎著床及蛻膜化過程中表達(dá)調(diào)節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)研究。這些工作將有助于揭示該基因的功能，并且對(duì)研究與治療人類很多原因不明的不孕癥、提高家畜的繁殖率等提供重要的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)：Barak Y et al，2002. Proc Natl Acad Sci USA. 99: 303308.Carolyn M et al, 2002. Biolog
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