省生物教學(xué)學(xué)會(huì)年會(huì)報(bào)告(編輯修改稿)
2025-02-14 02:20 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 Northern雜交： 通過(guò)顯影檢查目的 DNA所在的位置 。 Southern雜交和 Northern雜交過(guò)程示意圖 Western雜交 （檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)） ? 中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡技術(shù)。其基本原理是通過(guò) 特異性抗體 對(duì)凝膠電泳分離的細(xì)胞或生物組織 蛋白樣品 進(jìn)行檢測(cè)。 ? Western Blot與 Southern雜交或 Northern雜交方法類似，但 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)， “ 探針 ” 是抗體， “ 顯色 ” 用標(biāo)記的二抗。 Western雜交過(guò)程 ? ⑴ 經(jīng)過(guò) SDSPAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如 硝酸纖維素膜 ）上； ? ⑵以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)； ? ⑶再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的目的蛋白。 ? 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，從而可得知被檢細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)與否、表達(dá)量及分子量等情況。 Western雜交結(jié)果圖 常見(jiàn)載體容量 載體 質(zhì)粒 λ 噬菌體 黏粒 細(xì)菌人工染色體（ BAC） 酵母人工染色體（ YAC） 容量 （ kb) 10 23 45 350 1000 （二）細(xì)胞工程 動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體 細(xì)胞融合（ cell fusion)， 又稱體細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(guò)膜融合，形成單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。 細(xì)胞融合的常用方法 一、滅活病毒法： 二、聚乙二醇（ PEG）法： 三、電融合法： 一、滅活病毒法 1. 兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近； 2. 通過(guò)病毒與細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜互相滲透，胞質(zhì)互相滲透； 3. 兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體； 4. 進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。 二、聚乙二醇（ PEG）法 ? PEG分子式： HOH2C（ CH20CH2） nCH2OH，通常選用平均相對(duì)分子質(zhì)量為 1000～ 4000、濃度在 30%～ 50%的 PEG進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞的誘導(dǎo)融合。 ? PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成 H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合 . PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn) ： 其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，不需特殊設(shè)備；融合子異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。其缺點(diǎn)是操作過(guò)程繁瑣， PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。 三、電融合法 細(xì)胞首先在交流電場(chǎng)中極化并沿電力線排列成串，形成細(xì)胞間的緊密接觸；然后在高強(qiáng)度的直流電脈沖作用下，相互連接的細(xì)胞質(zhì)膜被擊穿而導(dǎo)致細(xì)胞融合。 電融合法的優(yōu)點(diǎn)： ?融合率高，重復(fù)性強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞傷害??； ?裝置精巧，方法簡(jiǎn)單，可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程； ?免去 PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程，誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。 融合細(xì)胞的篩選 ? 細(xì)胞融合后，會(huì)形成由未融合的親本細(xì)胞、同核體以及異核體組成的細(xì)胞混合群體?？筛鶕?jù)不同細(xì)胞生理生化特性的差異，設(shè)計(jì)具體的篩選方案和選擇體系，優(yōu)先選擇雜交細(xì)胞或只允許雜交細(xì)胞生長(zhǎng)，以淘汰親本細(xì)胞。最常用方法是應(yīng)用合適的選擇培養(yǎng)基，使親本細(xì)胞死亡，而僅讓雜交細(xì)胞存活下來(lái)。 ?基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選 ?基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選 ?由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選 ?具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選 常用的雜種細(xì)胞篩選方法 雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體 抗體
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