【文章內(nèi)容簡介】 21,42,63 00l l=3n 31,32,62,64 00l l=6n 61,65 三、晶體結(jié)構(gòu)測定 從晶體 X衍射圖的形狀及對稱性可以推算晶胞的大小和空間群 （ 可能不是唯一的 ） 。 用 X衍射方法解晶體結(jié)構(gòu)就是要進一步知道晶胞中原子的分布也就是原子坐標 。 根據(jù)上述公式只要知道每一衍射點的 |Fhkl|和α (hkl)就可算出晶胞中每一點的電子密度 ， 從中就可得到原子坐標 。 在衍射實驗中每一衍射點的實驗強度信息可以記錄 ， 由此可以推出 |Fhkl|，但每一衍射點的相角信息 α (hkl)卻丟失了 。 因此解晶體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵是相角問題 ， 有了相角 ， 原子坐標就迎刃而解了 。 晶胞中電子密度的分布函數(shù) ρ ( xy z)ρ ( xy z)=12VF i hx ky lzh k l e x p [ ( )]? ? ???? ? =12vF i hx ky lz h k lh k llkh| | e x p [ ( ) ( )]? ? ? ???? ? ? (1)Patterson函數(shù) 其意義是晶胞中相距為向量 (uvw)二點的電子密度乘積的平均，顯然如果兩個原子間的距離正好是向量 (uvw)，那么它的 p(uvw)值最大，所以 Patterson函數(shù)圖上的峰反映了原子間的向量，由于計算 p(uvw)時沒有相角問題，有了實驗測得的強度就可以算。問題是如何從 (uvw)峰得到原子坐標。 P( u v w) =12vC o s hu kv lw2h k l∞∞| F |??? ? ?? ( )來自 P( u v w) = ? ?( ) ( , , )x y z x u y v z w d x d y d z? ? ????(2)Patterson峰的特性 N(N1)+1。 與兩個原子的原子序數(shù) ZiZj成正比 。 i， 對稱元素的平移部分消失即螺旋軸 、 滑移面變成旋轉(zhuǎn)軸 、 鏡面 ， 所以只有 24種類型 （ 11 Laue群加上各個 Laue群可能的格子類型 ） 。 ， Harker峰 。 等效點之間的向量峰 ，稱 Harker峰 ， Harker峰所在的平面 ， 稱 Harker截面 。由旋轉(zhuǎn)軸聯(lián)系的兩個原子向量峰一定落在一個特殊的 Harker截面 ， 由鏡面 、 滑移面聯(lián)系的兩個原子向量峰一定落在一條特殊的線上 。 3)Patterson法解結(jié)構(gòu)一般步驟 n（ 根據(jù)晶體密度計算或估計 ） Patterson峰表 Harker峰 Patterson 函數(shù) （ 矢量圖 ） (或已知坐標的原子 )計算相角和電子密度圖 . 直到找出全部原子坐標 我們說從衍射實驗中，強度信息可以記錄，相角信息丟失了，但我們僅僅從衍射強度最終又可得到原子坐標，說明實際相角沒有真正的丟失，只是不能像強度那樣直接記錄，變成顯而易見的，它是隱含在強度信息之中的，因此選擇一些較強的衍射點，通過這些衍射點之間的相角關(guān)系信息，最終導出這些衍射點的相角，然而用這些衍射點計算 E圖（類似于電子密度圖），就可以得到某些原子的坐標信息，利用這些原子坐標可以計算所有衍射點的初步相角及電子密度圖，最終解出全部結(jié)構(gòu)。 四、蛋白質(zhì)晶體學 蛋白質(zhì)分子與小分子差別 (1)蛋白質(zhì)分子大多是 C、 H、 O、 N、 S組成 ， 少數(shù)有金屬離子如 Cu、 Zn等 ， 因此 ， 想用 Patterson 法來解大分子結(jié)構(gòu)要在晶體中引入定位的重原子 。 (2)組成蛋白質(zhì)大分子的單個氨基酸有不對稱碳原子 ， 而蛋白分子中又只有 L型氨基酸 ， 因此蛋白質(zhì)晶體的對稱元素只有對稱軸 ， 而沒有 m、 i。這樣 230空間群 ， 在蛋白質(zhì)晶體中只有 65種僅含對稱軸的空間群 。 (3)蛋白質(zhì)分子分子量較大，因此，不能用簡單的重原子的相角代替全體原子貢獻的相角。 1結(jié)晶 2數(shù)據(jù)收集與處理 3相角測定 4相角改進 5電子密度計算和解釋 6修正 蛋白質(zhì)純度 ,微觀均勻性 . 蛋白質(zhì)濃度 沉淀劑濃度 (NH4)2SO4，各種分子量的 PEG、 MPD (二甲基2,4戊烷二醇 ). 影響有效濃度 添加劑 去污劑、金屬離子、還原劑 DTT， 針對蛋白本身性能 pH 緩沖液類型 有機緩沖液現(xiàn)更常用，磷酸緩沖液易生成磷酸鹽。影響殘基的解離常數(shù) 離子強度 影響靜電相互作用 鹽析鹽溶也是影響有效濃度 溫度 一般不敏感 生復合物晶體 抑制劑、輔因子、底物、 Fab片段 截去柔性過大的 C端或 N端，以甘油作輔助溶劑 長突變體蛋白 如何選擇突變位點是關(guān)鍵 最常用的氣相擴散法 (懸滴、坐滴 )，平衡透析法 晶體到探測器的距離：晶胞越大該距離應加大 ，以免衍射點重疊 。 分辨率：晶體衍射能力強則應收高分辨率數(shù)據(jù) ，θ 角大分辨率高但收高分辨率數(shù)據(jù)時必定會犧牲低分辨率數(shù)據(jù)質(zhì)量 。 所以對一個新蛋白來說 ， 也可先收一次中等分辨率的數(shù)據(jù) ， 以滿足起始工作的要求 。 如用分子置換法 ， 則最初用 4A數(shù)據(jù)也可以了 。 多對同晶置換法跟蹤肽鏈走向時有 3A電子密度圖也足夠了 。 低分辨率電子密度圖比高分辨率電子密度圖連續(xù)性好 ， 當然粘連也嚴重 。 徊擺角度：在不增加衍射點重疊條件下 ， 徊擺角盡量大 ， 這與晶胞大小有關(guān) 。 100A左右大約每幅畫面 1－ 2176。 曝光時間：取決于晶體衍射能力和晶體在 X－射線下的壽命 （ 或穩(wěn)定性 ） 。 如果衍射能力弱 ， 壽命又短 ， 則要在這二者之間取得平衡 ， 減少曝光時間可收集更多畫面得到一套完整的數(shù)據(jù) ， 但衍射點強度相對弱 ， 數(shù)據(jù)誤差可能大一些 。 加長曝光時間可能要兩顆晶體才能收集一套完整數(shù)據(jù) ，則數(shù)據(jù)合并時也會加大數(shù)據(jù)的誤差 。 在一定分辨率下衍射點數(shù)的估算 [(4/3)π (1/dm)3]/(1/v)247。 n = (4/3)π (v/dm) 減少盲區(qū)：用較短的波長 （ 這在同步輻射中能實現(xiàn) ） 或把晶體對稱軸略偏旋轉(zhuǎn)軸幾度 （ 這比較費時 ， 不值得嘗試 ） 最有效的收集數(shù)據(jù) ， 主對稱軸為徊擺軸 ， 間隔地分段收集 ， 減少晶體損傷與吸收 ， 用較短波長 增大反常散射效應 用接近元素吸收邊的波長 （ Denzo程序） 我們知道每幅畫面上的衍射點的位置及其指標是有許多因素決定的。當然晶體的晶胞參數(shù)是最重要的決定因素，其次是晶體對 X射線的取向。另外晶體的鑲嵌度 (mosaicity)，入射線的位置，每幅畫面迥擺角的范圍，晶體到 IP的距離等各種因素都對衍射點的位置有影響。這些參數(shù)有的是完全不知道的，有些雖知道但還需更精確的數(shù)值，以便使預測點和實際點更符合。為了得到正確的衍射強度，要選擇適當?shù)难苌潼c大小 (spot)和積分面積 (box)。執(zhí)行 Denzo程序就能使未知的參數(shù)如晶胞參數(shù)晶體取向參數(shù)變成已知，不精確的參數(shù)更精確了。 使用 Denzo一般分三步 . 第一步自動指標化 ， 得到晶體的格子類型 ， 晶胞參數(shù) ， 晶體取向參數(shù) ， X射線位置座標等信息 。如果顯示的預測點和實際衍射點基本一致 ， 則自動指標化過程正常 。 并輸出 14種格子和晶胞參數(shù)變形表 ， 晶體取向參數(shù)等信息 。 選取最高對稱性而又有最小變形的格子 ， 作為你的晶體可能的格子類型 。 第二步用 Fit命令修正有關(guān)的參數(shù) 。 一般先修正晶體取向參數(shù) ， 晶胞參數(shù)和射線位置參數(shù) ， 并從中等分辨率逐漸向高分辨率擴展 。 注意有些參數(shù)是高度相關(guān)的 ， 不要同時修正 ， 除非你有高質(zhì)量高分