【文章內(nèi)容簡介】 。因此，升華法還需要進行進一步研究和探討和優(yōu)化。5 pH值對MALDI的影響自基體輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI)面世不久，人們即發(fā)現(xiàn)基體溶液的pH值對測定結(jié)果有影響，基體在輔助激光解吸電離樣品過程產(chǎn)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移的作用機理已得到了普遍的認同[20]，因此人們都傾向于選用pH值偏于酸性的基體，%三氟醋酸水溶液[21] 。Ehring等[22]認為MALDI法只能在基體化合物溶液的等電點或酸性情況下才能進行，如果基體溶液的pH值高于pKa值時，基體將以陰離子存在，在溶劑揮發(fā)后，就形成了相應(yīng)的鹽而不能起輔助解吸電離的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，利用2，5二羥基苯甲酰肼衍生化試劑引入碳納米管材料（CNT）后可作為MALDI基質(zhì)和PH值調(diào)節(jié)劑，2，5二羥基苯甲酰肼衍生化試劑能在CNT表面引入酚羥基和苯基，前者能提供可變的表面電荷和質(zhì)子來源；后者可成為強烈的自外激光吸收體。，比表面積增大，從而為吸附痕量的多肽提供了很大的空間。而在pH為5的條件下，吸附了樣品的CNT開始沉積，與樣品溶液達到完美的分離。這為快速分離和提取技術(shù)的發(fā)展提供了有力的支持，克服了早期CNT材料在樣品提取和富集方面的不足，很大程度上提高質(zhì)譜離子化效率和檢測限，用于痕量多肽的研究。實驗表明，通過如上的pH調(diào)節(jié)，仍能通過此法達達檢測要求[23]。6 MALDI中金屬離子的引入與MALDI分析生物分子相比，合成高分子的離子化在多數(shù)情況下是金屬離子陽離子化而不是質(zhì)子化。因此，僅僅優(yōu)化基質(zhì)是不夠的。而應(yīng)該與金屬離子同時考慮。對于相對于極性較大的高分子，在MALDI分析中一般是鉀離子化或鈉離子化[24]。 金屬離子的引入，在大分子化合物分析中往往能提供特征化的碎片離子，在化合物結(jié)構(gòu)確定，特征離子的選擇，目標物定量分析中有著重要的作用。David H. Russell等人報道了一種新的含銅離子的基質(zhì)，能讓被測物產(chǎn)[M+xCu(x1)H]+ (x=16)離子——α腈基4羥基苯丙烯酸（CHCA）銅離子復(fù)合物[（CHCA）4Cu2]。（CHCA）4Cu2可由CHCA和氧化亞銅反應(yīng)得到。作者發(fā)現(xiàn)，激光解析后產(chǎn)生的加合離子豐度明顯高于普通基質(zhì)產(chǎn)生的[M+Cu]+離子，同時這為人們研究銅離子與肽結(jié)合并在氣相中的相互作用提供了可靠依據(jù)和有效途徑。其反應(yīng)機理有待于進一步研究[25]。7其他添加劑及無機材料的應(yīng)用碳納米管自從1991年被Iijima[21，22]發(fā)現(xiàn)以來，因為其獨特的結(jié)構(gòu)，電學(xué)和機械特性使得在MALDI技術(shù)里引入碳納米管作為基質(zhì)添加劑和離子化輔助劑已逐漸成為一種新的方法。很多已發(fā)表的工作[2628]都利用其本身以及衍生化材料和技術(shù)對小分子中性物質(zhì)進行分析和檢測。有人報道[29]利用碳納米材料的疏水性，在樣品溶液中加入10μL碳納米管甲醇（50%，vol/vol）懸濁液，將分析物提取到碳納米管表面，經(jīng)過離心，碳納米管沉積到試管底部。除去上清液，加入分散劑使其再次懸浮，利用吸量管直接將其定量轉(zhuǎn)移至樣品靶作進一步分析。事實證明，對于小分子物質(zhì)的分析，用碳納米管作為基質(zhì)，樣品的離子化效率和峰分辨率明顯高于活性炭。在此之前的方法，僅僅將樣品沉積在單層碳納米材料表面，沒有萃取的過程；而在這整個分析過程中，碳納米管發(fā)揮了雙重作用：前處理過程中的固相萃取劑和MALDI分析的基質(zhì)。作者在此選用了BArg（Nα苯甲酰L精氨酸）, BAEE（Nα苯甲酰L精氨酸乙酯）, propranolol（普奈洛爾）, quinine（奎寧）, LeuTyr（亮氨酸酪氨酸二肽）, LeuMet（亮氨酸甲硫氨酸二肽）幾種小分子， 比較了使用碳納米管和活性炭各自的峰強度，信噪比以及分辨率見表一。碳納米管有著比活性炭更小的體積，并且在結(jié)構(gòu)上，碳納米管外側(cè)有很多共軛的電子，可以很好地吸收和傳遞紫外光的能量，而活性炭卻無法通過共軛電子流暢地將能量傳遞給被測物，因此從下表我們可以看出，所有的參數(shù)，碳納米管都優(yōu)于活性炭。表一 碳納米管（CNTs）與活性炭（AC）各參數(shù)比較（N代表未檢出）同時作者在實驗中發(fā)現(xiàn)，分析物的信號存在時間較短，碳納米管在真空中由于溶劑的揮發(fā)很難固定在樣品靶上，容易脫離。而在分散劑中加入甘油和蔗糖添加劑，分辨率可以得到提高同時減少可能的離子源污染。這一思路來源于SALDI（表面增強激光解析離子化）的應(yīng)用。筆者深信，碳納米管等無機材料鼻尖得到廣泛的應(yīng)用，并在小分子的檢測中發(fā)揮重要的作用。目前有一種新的實驗設(shè)計[30]對樣品進行預(yù)處理，即在利用MALDITOF對樣品進行快速、高質(zhì)量分析之前，將不銹鋼樣品板用以下三種物質(zhì)之一進行涂漬覆蓋：礦物油，甘油，或者凡士林，并且對降血鈣素，胰島素等多肽及其混合物在未覆蓋以上三種物質(zhì)之一的樣品板以及覆蓋了的樣品板上的分析進行比較。發(fā)現(xiàn)，覆蓋之后，樣品的信號強度和檢測限都有所提高。同時，作者用Sephadex LH20微柱處理后的人血清蛋白檢驗了此法的精密度和重現(xiàn)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，覆蓋后的樣品板在分析時，能夠測出更多痕量物質(zhì)，從而說明了該法優(yōu)越性。作者認為，這種把微柱分離技術(shù)和此法結(jié)合，已可直接用于對生物體液進行檢測。另外，作者檢驗了覆蓋樣品板對鹽的耐受性，所用物質(zhì)為氯化鈉和尿素濃縮物。測試發(fā)現(xiàn)，覆蓋處理后，樣品對鹽的耐受有所增強，特別是稀釋后的樣品。作者也通過靶上沖洗的方法對樣品進行脫鹽處理，所采用的清洗溶液可以是1%的三氟醋酸（TFA）或用蒸餾水。處理后比較兩種樣品板發(fā)現(xiàn)，未進行涂漬處理的板，由于沒有涂漬物的固定吸附作用，樣品會先從板上流失，損失很大，達不到脫鹽的效果。而覆蓋后，由于涂漬物與樣品的作用，樣品不容易被沖洗掉，從而在盡量減少樣品丟失的情況下，使得脫鹽效率顯著提高。此外，處理后的樣品板裝載樣品檢測使質(zhì)譜強度大大提高，這有利于MALDITOF對大分子檢測。此法簡單易行，耗時短，重現(xiàn)性、靈敏度高，對鹽耐受性高，樣品板便于清洗，同時一定程度下能減少基質(zhì)效應(yīng)，不失為一種較好的樣品處理技術(shù)。8 結(jié)論與展望20世紀70年代以來，利用質(zhì)譜來測定多肽、蛋白質(zhì)、人工合成高聚物等已經(jīng)取得了長足的進步。而這很大程度上要歸因于先進的離子化技術(shù)的發(fā)展，如：MALDI，APPI，SELDI等。換句話說，這些新技術(shù)為我們在分析這些大分子化合物時，保證了良好的分辨率和準確度。如今，痕量（fmol級別）的多肽和蛋白質(zhì)的分析鑒定已經(jīng)日趨成熟，而蛋白質(zhì)質(zhì)譜成像和結(jié)構(gòu)確定也變得非常簡單。我們都知道凝膠電泳在分子生物學(xué)相關(guān)分析中的重要地位，同時，我們也可以斷定，質(zhì)譜法憑借著它的高靈敏度，高精確性和準確度以及高通量的優(yōu)勢迅速成為獨樹一幟的分析方法，以上的應(yīng)用只是質(zhì)譜MALDI的應(yīng)用的一小部分，我們相信，這些方法和技術(shù)在不久的將來會不斷完善[31]，同時，新的樣品預(yù)處理方法，新脫鹽試劑的應(yīng)用以及新基質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，必將把MALDITOF的應(yīng)用推上一個新的臺階。參考