體外轉(zhuǎn)錄與翻譯ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-10 07:15 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 染細(xì)胞。 網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破壞內(nèi)源 mRNA，最大限度降低翻譯背景。 裂解物包含蛋白質(zhì)臺(tái)成所必須的細(xì)胞內(nèi)組分 (tRNA，核糖體，氨基酸，起始、延伸、終止因子 )。 為使系統(tǒng)更適于 mRNA 的翻譯，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中還添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng)，以及氯化高鐵血紅素防止翻譯起始的抑制，此外還添加了 tRNAs混合物用于擴(kuò)大 mRNA翻譯的范圍，以及乙酸鉀和乙酸鎂等。 兔網(wǎng)織紅細(xì)胞具有一定的翻譯后加工活性，包括翻譯產(chǎn)物的乙?；?，異戊 二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信號(hào)肽切除以及蛋白質(zhì)糖基化等翻譯后加工事件可以通過加入犬微粒體膜來實(shí)現(xiàn)。 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作 基因體外翻譯系統(tǒng) （ 1）兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng) 體外翻譯系統(tǒng)中兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)是真核體外翻譯系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的一種，常用于較大的 mRNA種類鑒定，基因產(chǎn)物性質(zhì)的分析，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的研究，以及共翻譯加工的研究等。 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作 基因體外翻譯系統(tǒng) （ 2）麥芽提取物 Wheat Germ Extract 麥胚提取物的制備 通過碾磨麥胚，離心去除細(xì)胞殘?jiān)?，上清液通過層析將抑制翻譯的內(nèi)源氨基酸和植物色素等分離出去。 提取物用微球菌核酸酶處理 破壞內(nèi)源 mRNA，是大限度降低翻譯背景。 提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng)和增加鏈延伸效率的亞精胺，以及一定量的乙酸鎂。 麥胚提取物系統(tǒng)可穩(wěn)定地表達(dá)一些在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯受到抑制的 DNA 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作 基因體外翻譯系統(tǒng) （ 2）麥芽提取物 Wheat Germ Extract 麥芽提取物是不同于網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的另一個(gè)無(wú)細(xì)胞體外合成體系。由于內(nèi)源的 mRNA很少，這個(gè)系統(tǒng)可用于各種病毒、酵母、高等植物乃至哺乳動(dòng)物蛋白的合成。當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物較難與球蛋白區(qū)分（ 12— 15kD）、或者表達(dá)產(chǎn)物正好可能是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中富含而植物中沒有的調(diào)控因子一類的蛋白時(shí)、或者是不明原因表達(dá)不出時(shí)，就不妨嘗試麥芽提取物體系。不過要記住，這個(gè)體系要求 RNA有帽子結(jié)構(gòu) 才能更好的翻譯。如果上述情況又無(wú)法給 RNA加帽，就只好借助大腸桿菌體系了 。 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯 四、基因體外翻譯的原理與操作 基因體外翻譯系統(tǒng) （ 3）細(xì)菌提取物 E. coli CellFree System 原核系統(tǒng)主要利用大腸桿菌的提取物進(jìn)行表達(dá)。利用大腸桿菌體系進(jìn)行體外表達(dá)，某些蛋白質(zhì)每小時(shí)每個(gè)反應(yīng)（ 50ul）產(chǎn)物量可高達(dá)數(shù)百微克，在優(yōu)化的批量系統(tǒng)中蛋白最終的產(chǎn)量達(dá)到 1mg/ml也是可能達(dá)到的，這一產(chǎn)率還可以通過連續(xù)反應(yīng)器進(jìn)一步得到提高。 人們可以根據(jù)需要加入特殊添加劑如蛋白酶抑制劑，分子伴侶，代謝物，非天然氨基酸甚至是少量的變性劑，也可摻入特殊標(biāo)記的氨基酸獲得帶標(biāo)記蛋白質(zhì)。這樣這種體系的彈性就非常大，可以加入許多其它優(yōu)化成份以提高產(chǎn)率和提高溶解性。 大腸桿菌的材料來源成本最低，實(shí)用性高，表達(dá)效率也高
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