【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 法 8．差速離心法；密度梯度離心法 9．滅活仙臺(tái)病毒；聚乙二醇 10．＜8 000r／ min； 8 000～ 25 000r／ min； 25 000～ 85 000r／ min 11．沉降系數(shù)（ S）；大小；形狀；密度 12．雜交瘤；單克隆抗體 13．離心沉淀；介質(zhì)粘附；流式細(xì)胞 14．氨基酸；維生素；無(wú)機(jī)鹽；小牛血清 15． HeLa 細(xì)胞系； 3T3 細(xì)胞系； CHO 細(xì)胞系 16．異核體；雜種細(xì)胞 17．細(xì)胞群；克隆 18．紫外光；綠色；紅色 19．戊二醛；四氧化鋨 20．固定；脫水；干燥；鍍膜 名詞解釋 1．分辨率，也稱分辨本領(lǐng)。指顯微鏡或人眼在 25cm 的明視距離處分辨或 區(qū)分被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu)的最小間隔，即兩點(diǎn)間最小距離的能力。能夠區(qū)分的兩點(diǎn)間的距離越小，表示分辨率越高。顯微鏡的分辨率由物鏡所決定，與其鏡口率和光線的波長(zhǎng)直接相關(guān)。人眼的分辨率約為100μ m，而光鏡的分辨率最高可達(dá) m，電鏡的分辨率比光鏡高 100～ 1 000 倍，達(dá) 2～。 2．顯微結(jié)構(gòu)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡所觀察到的樣品的各種結(jié)構(gòu)。如細(xì)胞的大小、外部形態(tài)以及細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、中心體等內(nèi)部構(gòu)成都屬于顯微結(jié)構(gòu)。 3．超微結(jié)構(gòu)，也稱為亞顯微結(jié)構(gòu) (submicroscopic structure)。指在 電子顯微鏡下所觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、中心體、核糖體、微管、微絲等細(xì)胞器的微細(xì)結(jié)構(gòu)等。 ★ 4．冷凍蝕刻復(fù)型，掃描電鏡樣品制備技術(shù)的一種。其基本過(guò)程是先將組織或細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行超低溫冷凍 (液氮中 )，然后在真空中割斷樣品再稍升溫使冰升華完成蝕刻，此時(shí)細(xì)胞斷面出現(xiàn)被蝕刻后的浮雕效果，再將樣本噴上金或鉑和碳，最后將組織細(xì)胞溶解掉剩下能反映細(xì)胞蝕刻面形貌的碳金屬膜的復(fù)型。將該復(fù)型放入電鏡下可觀察到立體感強(qiáng)、分辨率高的細(xì)胞斷面各種微細(xì)結(jié)構(gòu)的圖像。 ★ 5．克隆，在細(xì)胞生物學(xué)中，克隆指由單個(gè)細(xì)胞經(jīng)有絲分 裂形成的細(xì)胞群。通過(guò)細(xì)胞克隆的方法可制備出生物學(xué)性狀均一的細(xì)胞系。 ． ★ 6．細(xì)胞系，可在體外培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代 (無(wú)限制地傳代 )的細(xì)胞群。其細(xì)胞的特點(diǎn)是染色體數(shù)目明顯改變，一般呈亞二倍體或非整倍體；失去一般體細(xì)胞具有的接觸抑制的特性而具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，容易傳代培養(yǎng)。例如細(xì)胞生物學(xué)研究中常用的 HeLa 細(xì)胞系 (由人宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成 )、 CHO 細(xì)胞系 (由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)而成 )、 BHK21 細(xì)胞系 (倉(cāng)鼠 AAJ鼠腎成纖維細(xì)胞 )和 3T3 細(xì)胞系 (來(lái)源于小鼠胚胎細(xì)胞 )。 ★ 7．細(xì)胞培養(yǎng)，使離體細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室人工模擬 機(jī)體內(nèi)的條件下 (如合適的溫度、全面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等 )生長(zhǎng)發(fā)育、分裂增殖的一項(xiàng)重要的細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞作為研究所需的材料，如細(xì)胞增殖周期及調(diào)控、細(xì)胞癌變機(jī)理與衰老、基因表達(dá)與控制以及細(xì)胞雜交等多個(gè)方面的研究都離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)?？煞譃樵囵B(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩個(gè)階段或兩種類(lèi)型。 8．原代培養(yǎng)，指從機(jī)體組織中取材后接種到培養(yǎng)基中所進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)，即直接取材于機(jī)體組織的細(xì)胞培養(yǎng)。所形成的細(xì)胞稱原代細(xì)胞，它是在體外培養(yǎng)任何一種體細(xì)胞所必須經(jīng)歷的階段和傳代培養(yǎng)的基礎(chǔ)。也就是說(shuō)，任何動(dòng)物和人體細(xì)胞的培養(yǎng)均 需從原代細(xì)胞培養(yǎng)做起。一般來(lái)說(shuō)，胎兒的腎、肺、卵巢、精巢、肌肉與腫瘤等組織的細(xì)胞較易培養(yǎng)，而神經(jīng)細(xì)胞較難培養(yǎng)。 9．傳代培養(yǎng)，簡(jiǎn)稱傳代，指當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)、增殖到一定密度后，一分為二或以其他比例分裝或轉(zhuǎn)移到 2 個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中所進(jìn)行的再培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，要使細(xì)胞能夠在容積中正常地生長(zhǎng)和繁殖需要經(jīng)常進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的傳代，所以傳代培養(yǎng)可多次進(jìn)行。適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。傳代累積的次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。一般來(lái)講，原代培養(yǎng)的細(xì)胞傳至 10 代就不易傳下去了，其生長(zhǎng)出現(xiàn)停滯且大多數(shù)細(xì)胞衰老死亡，只有極少數(shù)細(xì)胞能存活下來(lái)并繼續(xù)傳代 40～ 50 次。在此過(guò)程中，細(xì)胞保持染色體數(shù)目穩(wěn)定和接觸抑制行為。當(dāng)細(xì)胞傳至 50 代以后又會(huì)出現(xiàn) “危機(jī) ”不能傳下去了，但其中少數(shù)發(fā)生突變，獲得了癌變細(xì)胞特性，細(xì)胞有可能無(wú)限制地傳下去，如 HeLa 細(xì)胞株。 10．接觸抑制，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的一種有趣現(xiàn)象。在培養(yǎng)開(kāi)始后，分散的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)瓶中不久就會(huì)貼附在瓶壁上，原來(lái)呈圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁便會(huì)迅速鋪展而變成多種形態(tài)，隨即細(xì)胞開(kāi)始分裂，貼壁生長(zhǎng)形成致密的單層細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，就會(huì)停止增殖，維持相互 接觸的單層細(xì)胞狀態(tài)直至衰老，這就是所謂的接觸抑制。 ★ 11．非細(xì)胞體系，包含有進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)正常生物學(xué)過(guò)程所需的成分但不具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的體外實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系。一般由活細(xì)胞經(jīng)裂解破碎、超速離心除去某些成分后制備而來(lái)。非細(xì)胞體系在研究探討 DNA 復(fù)制、 RNA 轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、核膜及染色質(zhì)的組裝等細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)的基本過(guò)程和機(jī)理方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。 ★ 12．原位雜交，利用放射性同位素或非放射性物質(zhì) (如地高辛或生物素 )標(biāo)記的核酸探針與玻片上的細(xì)胞核中或染色體上的某種核苷酸順序或基因進(jìn)行雜交以確定該基因座位的一種重要技術(shù)。 其基本程序是，先制備組織切片或染色體玻片標(biāo)本和所需的核酸探針，再將玻片加熱使細(xì)胞核或染色體中的 DNA 變性成單鏈狀態(tài)，滴加含有探針的緩沖液至玻片上在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行雜交，最后用放射自顯影或免疫顯色、酶促顯色反應(yīng)顯示目標(biāo)基因或核酸順序所在位點(diǎn)。 問(wèn)答題 1．電子顯微鏡是以電子束為照明源，通過(guò)電子流對(duì)樣品的透射或反射及電磁透鏡的多級(jí)放大后在熒光屏上成像的大型儀器，而光學(xué)顯微鏡則是利用可見(jiàn)光照明，將微小物體形成放大影像的光學(xué)儀器。概括起來(lái)，電鏡與光鏡主要有以下幾個(gè)方面的區(qū)別：①照明源不同。電 鏡所用的照明源是電子槍發(fā)出的電子流，而光鏡的照明源是可見(jiàn)光 (日光或燈光 )，由于電子流的波長(zhǎng)遠(yuǎn)短于光波波長(zhǎng)，故電鏡的放大及分辨率顯著地高于光鏡。②透鏡不同。電鏡中起放大作用的物鏡是電磁透鏡 (能在中央部位產(chǎn)生磁場(chǎng)的環(huán)形電磁線圈 )，而光鏡的物鏡則是玻璃磨制而成的光學(xué)透鏡。電鏡中的電磁透鏡共有三組，分別與光鏡中聚光鏡、物鏡和目鏡的功能相當(dāng)。③成像原理不同。在電鏡中，作用于被檢樣品的電子束經(jīng)電磁透鏡放大后打到熒光屏上成像或作用于感光膠片成像。其電子濃淡的差別產(chǎn)生的機(jī)理是，電子束作用于被檢樣品時(shí)，入射電子與物質(zhì)的原子發(fā) 生碰撞產(chǎn)生散射，由于樣品不同部位對(duì)電子有不同散射度，故樣品電子像以濃淡呈現(xiàn)。而光鏡中樣品的物像以亮度差呈現(xiàn)，它是由被檢樣品的不同結(jié)構(gòu)吸收光線多少的不同所造成的。④所用標(biāo)本制備方式不同，電鏡觀察所用組織細(xì)胞標(biāo)本的制備程序較復(fù)雜，技術(shù)難度和費(fèi)用都較高，在取材、固定、脫水和包埋等環(huán)節(jié)上需要特殊的試劑和操作，最后還需將包埋好的組織塊放人超薄切片機(jī)切成 50～ 100nm 厚的超薄標(biāo)本片。而光鏡觀察的標(biāo)本則一般置于載玻片上，如普通組織切片標(biāo)本、細(xì)胞涂片標(biāo)本、組織壓片標(biāo)本和細(xì)胞滴片標(biāo)本等。 2．一般來(lái)說(shuō)，由于電子的穿 透力很弱，只能透過(guò)極薄的物體，組織細(xì)胞必須經(jīng)超薄切片后才能放入透射電鏡中觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。具體講，透射電鏡所用的標(biāo)本一般要切成50～ 100nm 厚的薄片，即一個(gè)細(xì)胞要切成 100～ 200 片。超薄切片的制備是電鏡技術(shù)的一個(gè)重要方面。它包括一系列復(fù)雜的處理過(guò)程和某些獨(dú)特的技術(shù)環(huán)節(jié)：①固定。這是電鏡樣品制備的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其目的是使樣品中細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及各種成分保持在生前狀態(tài)而不發(fā)生改變。固定要及時(shí)和徹底，為了達(dá)到良好的固定效果，組織的取材也很重要，盡量實(shí)施活體取材，且整個(gè)取材操作最好在 1 分鐘內(nèi)完成。待固定的組織的 體積要小，通常切成 見(jiàn)方的小塊，否則影響固定效果，獲得所需組織材料后應(yīng)立即投入固定液中。通常采用戊二醛和四氧化鋨對(duì)標(biāo)本進(jìn)行雙重固定，其中戊二醛可在蛋白質(zhì)分子之間形成共價(jià)鍵使它們交聯(lián)固定，而四氧化鋨除了與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合外，還對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)在內(nèi)的多種成分有良好的固定作用。②包埋，即先將固定和脫水處理后的標(biāo)本放入液態(tài)的包埋劑 (常用環(huán)氧樹(shù)脂 )中浸透，再對(duì)包埋塊加溫使之聚合成含有待切標(biāo)本的固體包埋塊。②超薄切片。將包埋塊經(jīng)適當(dāng)修整后放入超薄切片機(jī)中按操作程序用玻璃質(zhì)地的切刀切成薄片。切下的薄片一般置于銅質(zhì)的載網(wǎng)(相當(dāng)于載玻片 )上。④染色。由于電子的波長(zhǎng)單一，故細(xì)胞樣品在電子束的照射下既不能產(chǎn)生顏色的差別，也不易產(chǎn)生足夠的明暗差別 (反差 )，故載網(wǎng)上的超薄切片一般還需經(jīng)重金屬鹽染色，這種利用重金屬來(lái)增加細(xì)胞某些成分的電子散射能力從而增大標(biāo)本反差的染色稱為電子染色。常用的電子染色劑是醋酸鉛和檸檬酸鈾。位于銅網(wǎng)上的標(biāo)本經(jīng)鉛或鈾染色后即可放入透射電鏡中觀察了。一般認(rèn)為，利用超薄切片法可以觀察到細(xì)胞中幾乎所有的超微結(jié)構(gòu)。 3．目前用于細(xì)胞或細(xì)胞生物學(xué)研究的常用技術(shù)和手段有以下多種：①觀察細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡技術(shù)；② 探索細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電子顯微鏡技術(shù)；⑧研究蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)的 X 線衍射技術(shù)；④用于分離細(xì)胞內(nèi)不同形態(tài)大小細(xì)胞器的離心技術(shù)；⑤用于培養(yǎng)具有新性狀細(xì)胞的細(xì)胞融合或雜交技術(shù)；⑧使機(jī)體細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；⑦能對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)并測(cè)其體積、 DNA 含量等數(shù)據(jù)的流式細(xì)胞光度 (分選 )術(shù)；⑧利用放射性同位素對(duì)細(xì)胞中的 DNA、 RNA 或蛋白質(zhì)進(jìn)行示蹤或定位的放射自顯影技術(shù)；⑧用于探測(cè)基因組中某種基因是否存在、是否表達(dá)以及拷貝數(shù)多少的核酸分子雜交技術(shù)；⑩能將細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或核酸分子進(jìn)行分離純 化的層析技術(shù)和電泳技術(shù)等。 4．從多種細(xì)胞的懸液 (如血液 )分離不同細(xì)胞常用的方法有離心分離法、親和分離法和流式細(xì)胞術(shù)分離法等。離心法的原理是，不同種類(lèi)的細(xì)胞，其大小、形態(tài)、密度、質(zhì)量等物理性質(zhì)不同，在離心力的作用下，它們具有不同的沉降速率，從而得以分離。親和法分離細(xì)胞是利用一些細(xì)胞對(duì)玻璃或塑料具有較大的粘附力的特點(diǎn)。也可先將某種細(xì)胞的抗體結(jié)合到塑料或其他載體表面形成親和表面，再使含待分離細(xì)胞的細(xì)胞懸液接觸親和表面，使待分離細(xì)胞與抗體結(jié)合而留在親和表面，最后，利用輕微振蕩的辦法將被粘附的細(xì)胞回收起來(lái)。 也可用酶 (如膠原酶 )來(lái)消化分解基質(zhì) (如膠原 )，回收已得以分離的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)是最精確的細(xì)胞分離技術(shù)，其原理是，先將結(jié)合有熒光染料的抗體標(biāo)記待分離細(xì)胞，再將細(xì)胞懸液注人流式細(xì)胞計(jì)，在該儀器中，細(xì)胞懸液被加壓后從小孔徑的噴嘴噴出后又經(jīng)超聲振蕩作用變成含單個(gè)細(xì)胞的一連串液滴，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)激光束時(shí)根據(jù)其是否發(fā)熒光 (即是否被熒光標(biāo)記 )而被充以負(fù)電荷或正電荷，最后當(dāng)液滴通過(guò)強(qiáng)電場(chǎng)時(shí)，攜帶不同電荷的液滴分別朝不同方向偏轉(zhuǎn)進(jìn)入不同的分選收集容器中，這樣獲得要分離的細(xì)胞。 5．細(xì)胞內(nèi)不同組分的分級(jí)分離的常用方法有超速 離心法、層析法、電泳法等。超速離心技術(shù)可將細(xì)胞勻漿中的不同細(xì)胞器或生物大分子進(jìn)行有效分離。因?yàn)椴煌螒B(tài)、大小和密度的細(xì)胞器以及不同分子量的生物大分子在離心力作用下沉降速度各不相同。超速離心分離法又分差速離心和密度梯度離心兩種。差速離心是一種較為簡(jiǎn)便的分離法，常用于細(xì)胞核和細(xì)胞器的分離，因?yàn)樵诿芏染坏慕橘|(zhì)中，顆粒越大沉降越快，反之則沉降較慢。這種離心方法只能將那些大小有顯著差異的組分分開(kāi)，而且所獲得的分離組分往往不很純。而密度梯度離心則是較為精細(xì)的分離手段，這種離心方法的關(guān)鍵是先在離心管中制備出蔗糖或氯化銫等介質(zhì)的濃度梯度并將細(xì)胞勻漿裝在最上層，在此條件下離心，細(xì)胞不同組分將以不同速率沉降并形成不同沉降帶。呈密度梯度的介質(zhì)可以穩(wěn)定沉淀成分、防止對(duì)流混合。層析法是分離蛋白質(zhì)的常用手段，其基本原理是不同的蛋白質(zhì)分子其大小和所帶電荷不同，當(dāng)它們通過(guò)某種介質(zhì) (基質(zhì) )而與其發(fā)生相互作用時(shí)，會(huì)被不同程度地滯留或吸附，這樣便使不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)分子移動(dòng)的快慢不同，從而得以分離。如根據(jù)蛋白質(zhì)的大小、所帶電荷或特殊的化學(xué)基團(tuán)選擇不同的基質(zhì)的層析，如凝膠過(guò)濾柱層析、離子交換樹(shù)脂柱層析或親和層析等更可有效地分離不同的蛋白質(zhì)。電泳法是 分離蛋白質(zhì)、核酸的有效方法，在細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。其基本原理是，不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)或核酸所攜帶的凈電荷 (正與負(fù) )的性質(zhì)或多少不同，它們?cè)谝欢◤?qiáng)度的電場(chǎng)中會(huì)按所帶凈電荷、分子的大小和形狀以不同速度在電場(chǎng)中移動(dòng)，從而得以分離成不同的電泳帶譜。 ★ 6．追蹤活細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)合成與分泌的過(guò)程一般采用同位素示蹤技術(shù)。其基本步驟是：①將放射性同位素標(biāo)記的氨基酸 (如常用的 3H亮氨酸 )加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，在很短時(shí)間內(nèi)使這些與未標(biāo)記的相應(yīng)氨基酸化學(xué)性質(zhì)相同的標(biāo)記分子進(jìn)入細(xì)胞 (稱脈沖標(biāo)記 )；②除去培養(yǎng)液并洗 滌細(xì)胞，再換以含未標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，已進(jìn)入細(xì)胞的標(biāo)記氨基酸將被蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)作為原料加以利用，摻入到某種新合成的蛋白質(zhì)中；③每隔一定時(shí)間取出一定數(shù)量的細(xì)胞 (取樣 )，利用電鏡放射自顯影技術(shù)探查被標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)在不同時(shí)間所處的位置。具體說(shuō)，將每次取樣所得的細(xì)胞經(jīng)固定、包埋后制備成細(xì)胞的超薄切片，放到有支持膜的載網(wǎng)上，涂上核乳膠，放到暗處曝光一段時(shí)間，即讓細(xì)胞內(nèi)帶有放射性同位素的蛋白質(zhì)發(fā)射出的射線使核乳膠感光。然后將核乳膠顯影、定影便得到電鏡顯微放射自顯影的標(biāo)本。在電鏡下觀察該標(biāo)本中銀粒的分布、相關(guān)蛋 白質(zhì)在細(xì)胞中的位置以及數(shù)量的多少。通過(guò)比較不同時(shí)間細(xì)胞取樣的電鏡照片就可了解細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成及分泌的動(dòng)態(tài)過(guò)程。 細(xì)胞的分子基礎(chǔ)和細(xì)胞進(jìn)化 選擇題 A 型題 1．由非細(xì)胞原始生命進(jìn)化為細(xì)胞生物的轉(zhuǎn)變中，首先出現(xiàn)的是 A．細(xì)胞核