【文章內(nèi)容簡介】 ′).RT Ｇ PCR反應條件為９５ ℃ 下１ min。９４ ℃ 下３０ s,５６ ℃ 下３０ s,７２ ℃ 下３０ s運行２４個循環(huán)后 ７２ ℃ 下７ min. １．６ OsHox９的亞細胞定位 對于瞬時表達載體的構建 ,RNA從１５ d秧齡 水稻幼苗莖頂端分生組織中提取 ,PCR擴增 ４２２中國水稻科學 (ChinJRiceSci) 第２８卷第３期 (２０ １４年５月 ) OsHox９完整 ORF(去除終止密碼子 ),所用引物為 FHox９ F(５ ′ Ｇ TTAgagctcTGGTGGTGGAGGAGGA GGATＧ３ ′) 和 FHox９ R(５ ′ Ｇ ACTgtcgacCACGAAGG ACCAGTTGACGAＧ３ ′)( 小寫字母為酶切位點序 列 ),PCR條件為９８ ℃ 下３０ s。９８ ℃ 下１０ s,５９ ℃ 下 １５ s,７２ ℃ 下２ min運行３３個循環(huán)后７２ ℃ 下７ min. 擴增的特異片段克隆到空載體 pCAMBIA３５ S:: GFP中與 GFP基因融合 .測序鑒定正確的目的載 體 pCAMBIA３５ S::OsHox９Ｇ GFP注射煙草葉片 , 注射３ d后在共聚焦顯微鏡下觀察 . ２ 結果與分析 ２．１ OsHox９ RNAi表達載體的構建 為了揭示 OsHox９的功能 ,通過構建 RNAi載 體進行反向遺傳學分析 (圖１Ｇ A).４４１ bpOsHox９ 特異干涉片段利用 RTＧ PCR方法從水稻幼苗中獲 得 ,通過凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)目的條帶符合我們預期 結果 (圖１Ｇ B).首先將正向特異干涉片段用 BamH Ⅰ 和 KpnⅠ 與 RNAi空載體 pCAMBIA１３８１連接 后獲得中間載體 ,再將反向特異干涉片段用 SpeⅠ 和 SacⅠ 與獲得的中 間載體連接獲得最終的 pCAMBIA１３８１Ｇ OsHox９ RNAi表達載體 .連接好 的重組載體進行酶切鑒定 ,按預期用 BamHⅠ 和 SacⅠ 可切出約１３００ bp的片段 ,酶切結果與預期相 符 (圖１Ｇ C),說明正向和反向目的片段已連接到空 載體中 。進一步用 PCR方法驗證 ,結果表明每個克 隆都擴增出了預期的４４１ bp大小的目的條帶 (圖１Ｇ D),后經(jīng)測序驗證表明特異干涉片段已正確連接到 載體中 ,可以進行下一步的轉基因工作 . ２．２ 轉基因植株的 PCR檢測 將構建好的 pCAMBIA１３８１Ｇ OsHox９ RNAi載 體 用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法轉入水稻品種中花 １１中 ,共獲得了１６個獨立株系的１０４株 T０代 RNAi轉基因植株 .為了檢測構建的 RNAi載體是 否整合到水稻基因組中 ,我們提取這些轉基因植株 的基因組 DNA,用載體中特異的潮霉素基因引物 , 對 T０代轉基因植株進行 PCR檢測 ,結果表明１０４ 株轉基因植株中有８１株為轉基因陽性植株 (圖２ ), 陽性率約為７８％ . ２．３ 轉基因植株的表型觀察及表達分析 隨機種植７個獨立 T０代 RNAi轉基因陽性植 株獲得 T１代轉基因株系 ,觀察 T１代轉基因株系表 型發(fā)現(xiàn)７個株系中有３個株 系株高變矮 ,分蘗數(shù)減 少 ,并且抽穗日期有所推遲 (圖３Ｇ A、 B).另外 ,轉基 因植株的結實率也有所下降 .為了驗證轉基因植株 表型是否由 RNAi干涉所致 ,從植株葉片中提取７ A－ RNAi載體結構 。LB－ TＧ DNA左邊界 。p３５ S－花椰菜病毒３５ S啟動子 。OsHox９－ OsHox９正向特異干涉片段 。AntiＧ OsHox９－ OsHox９ 反向特異干涉片段 。Loop－內(nèi)含子序列 。RB－ TＧ DNA右邊界 。B－ OsHox９特異干涉片段 PCR擴增 .C－構建好的 RNAi載體的酶切鑒定 . D－ RNAi載體 PCR鑒定 。１－３ 分別代表 RNAi重組載體質粒 。P－空載體質粒 。M－ DNA標記 . A,RNAivector。LB,LeftborderofTＧ DNA。p３５ S,３５ Spromoterofcaulimovirus。OsHox９ ,ForwardinterferencefragmentofOsHox９ 。 AntiＧ OsHox９ ,ReverseinterferencefragmentofOsHox９ 。Loop,Intronsequence。RB,RightborderofTＧ DNA。B,AmplificationofOsHox９ interferencefragmentbyPCR。C,DetectionofenzymedigestioninRNAivector。D,DetectionofPCRinRNAivector。１－３ ,RNAi rebinantplasmid。P,Blankplasmid。M,DNAMarker． 圖１ RNAi載體的構建 Fig．１． ConstructionofRNAivector． ５２２艾麗萍等 :水稻同源異型域轉錄因子OsHox９的反向遺傳學分析 １－１４分別代表 T０代 RNAi轉基因植株 。P－ RNAi重組載體質粒 。WT－野生型中花１１ 。CK－ ddH２ O. １－１４ ,RNAitransgenicplants(T０ )。P,RNAirebinantplasmid。WT,WildtypeZhonghua１１ 。CK,ddH２ O． 圖２ T０代 RNAi轉基因植株 PCR檢測 Fig．２． PCRdetectionoftheRNAitransgenicplantsofT０ generation． A－抽穗期 。B－成熟期 。WT－野生型中花１１ 。RNAi－轉基因植株 。C和 D－ RNAi轉基因植株 RTＧ PCR和實 時 PCR表達分析 。１－７分別 代表７個獨立 T１代 RNAi轉基因植株 . A,Headingstage。B－ Maturestage。WT,WildtypeZhonghua１１ 。RNAi,Transgenicplants。CandD,RTＧ PCRandrealＧ timePCRanalysis ofOsHox９ expressioninRNAitransgenicplants。１－７ ,RNAit