【文章內(nèi)容簡介】 ′).RT Ｇ PCR反應(yīng)條件為９５ ℃ 下１ min。９４ ℃ 下３０ s,５６ ℃ 下３０ s,７２ ℃ 下３０ s運(yùn)行２４個(gè)循環(huán)后 ７２ ℃ 下７ min. １．６ OsHox９的亞細(xì)胞定位 對于瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建 ,RNA從１５ d秧齡 水稻幼苗莖頂端分生組織中提取 ,PCR擴(kuò)增 ４２２中國水稻科學(xué) (ChinJRiceSci) 第２８卷第３期 (２０ １４年５月 ) OsHox９完整 ORF(去除終止密碼子 ),所用引物為 FHox９ F(５ ′ Ｇ TTAgagctcTGGTGGTGGAGGAGGA GGATＧ３ ′) 和 FHox９ R(５ ′ Ｇ ACTgtcgacCACGAAGG ACCAGTTGACGAＧ３ ′)( 小寫字母為酶切位點(diǎn)序 列 ),PCR條件為９８ ℃ 下３０ s。９８ ℃ 下１０ s,５９ ℃ 下 １５ s,７２ ℃ 下２ min運(yùn)行３３個(gè)循環(huán)后７２ ℃ 下７ min. 擴(kuò)增的特異片段克隆到空載體 pCAMBIA３５ S:: GFP中與 GFP基因融合 .測序鑒定正確的目的載 體 pCAMBIA３５ S::OsHox９Ｇ GFP注射煙草葉片 , 注射３ d后在共聚焦顯微鏡下觀察 . ２ 結(jié)果與分析 ２．１ OsHox９ RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建 為了揭示 OsHox９的功能 ,通過構(gòu)建 RNAi載 體進(jìn)行反向遺傳學(xué)分析 (圖１Ｇ A).４４１ bpOsHox９ 特異干涉片段利用 RTＧ PCR方法從水稻幼苗中獲 得 ,通過凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)目的條帶符合我們預(yù)期 結(jié)果 (圖１Ｇ B).首先將正向特異干涉片段用 BamH Ⅰ 和 KpnⅠ 與 RNAi空載體 pCAMBIA１３８１連接 后獲得中間載體 ,再將反向特異干涉片段用 SpeⅠ 和 SacⅠ 與獲得的中 間載體連接獲得最終的 pCAMBIA１３８１Ｇ OsHox９ RNAi表達(dá)載體 .連接好 的重組載體進(jìn)行酶切鑒定 ,按預(yù)期用 BamHⅠ 和 SacⅠ 可切出約１３００ bp的片段 ,酶切結(jié)果與預(yù)期相 符 (圖１Ｇ C),說明正向和反向目的片段已連接到空 載體中 。進(jìn)一步用 PCR方法驗(yàn)證 ,結(jié)果表明每個(gè)克 隆都擴(kuò)增出了預(yù)期的４４１ bp大小的目的條帶 (圖１Ｇ D),后經(jīng)測序驗(yàn)證表明特異干涉片段已正確連接到 載體中 ,可以進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)基因工作 . ２．２ 轉(zhuǎn)基因植株的 PCR檢測 將構(gòu)建好的 pCAMBIA１３８１Ｇ OsHox９ RNAi載 體 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入水稻品種中花 １１中 ,共獲得了１６個(gè)獨(dú)立株系的１０４株 T０代 RNAi轉(zhuǎn)基因植株 .為了檢測構(gòu)建的 RNAi載體是 否整合到水稻基因組中 ,我們提取這些轉(zhuǎn)基因植株 的基因組 DNA,用載體中特異的潮霉素基因引物 , 對 T０代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行 PCR檢測 ,結(jié)果表明１０４ 株轉(zhuǎn)基因植株中有８１株為轉(zhuǎn)基因陽性植株 (圖２ ), 陽性率約為７８％ . ２．３ 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察及表達(dá)分析 隨機(jī)種植７個(gè)獨(dú)立 T０代 RNAi轉(zhuǎn)基因陽性植 株獲得 T１代轉(zhuǎn)基因株系 ,觀察 T１代轉(zhuǎn)基因株系表 型發(fā)現(xiàn)７個(gè)株系中有３個(gè)株 系株高變矮 ,分蘗數(shù)減 少 ,并且抽穗日期有所推遲 (圖３Ｇ A、 B).另外 ,轉(zhuǎn)基 因植株的結(jié)實(shí)率也有所下降 .為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株 表型是否由 RNAi干涉所致 ,從植株葉片中提?。? A－ RNAi載體結(jié)構(gòu) 。LB－ TＧ DNA左邊界 。p３５ S－花椰菜病毒３５ S啟動(dòng)子 。OsHox９－ OsHox９正向特異干涉片段 。AntiＧ OsHox９－ OsHox９ 反向特異干涉片段 。Loop－內(nèi)含子序列 。RB－ TＧ DNA右邊界 。B－ OsHox９特異干涉片段 PCR擴(kuò)增 .C－構(gòu)建好的 RNAi載體的酶切鑒定 . D－ RNAi載體 PCR鑒定 。１－３ 分別代表 RNAi重組載體質(zhì)粒 。P－空載體質(zhì)粒 。M－ DNA標(biāo)記 . A,RNAivector。LB,LeftborderofTＧ DNA。p３５ S,３５ Spromoterofcaulimovirus。OsHox９ ,ForwardinterferencefragmentofOsHox９ 。 AntiＧ OsHox９ ,ReverseinterferencefragmentofOsHox９ 。Loop,Intronsequence。RB,RightborderofTＧ DNA。B,AmplificationofOsHox９ interferencefragmentbyPCR。C,DetectionofenzymedigestioninRNAivector。D,DetectionofPCRinRNAivector。１－３ ,RNAi rebinantplasmid。P,Blankplasmid。M,DNAMarker． 圖１ RNAi載體的構(gòu)建 Fig．１． ConstructionofRNAivector． ５２２艾麗萍等 :水稻同源異型域轉(zhuǎn)錄因子OsHox９的反向遺傳學(xué)分析 １－１４分別代表 T０代 RNAi轉(zhuǎn)基因植株 。P－ RNAi重組載體質(zhì)粒 。WT－野生型中花１１ 。CK－ ddH２ O. １－１４ ,RNAitransgenicplants(T０ )。P,RNAirebinantplasmid。WT,WildtypeZhonghua１１ 。CK,ddH２ O． 圖２ T０代 RNAi轉(zhuǎn)基因植株 PCR檢測 Fig．２． PCRdetectionoftheRNAitransgenicplantsofT０ generation． A－抽穗期 。B－成熟期 。WT－野生型中花１１ 。RNAi－轉(zhuǎn)基因植株 。C和 D－ RNAi轉(zhuǎn)基因植株 RTＧ PCR和實(shí) 時(shí) PCR表達(dá)分析 。１－７分別 代表７個(gè)獨(dú)立 T１代 RNAi轉(zhuǎn)基因植株 . A,Headingstage。B－ Maturestage。WT,WildtypeZhonghua１１ 。RNAi,Transgenicplants。CandD,RTＧ PCRandrealＧ timePCRanalysis ofOsHox９ expressioninRNAitransgenicplants。１－７ ,RNAit