【文章內(nèi)容簡介】 3 3 術(shù)人員用傳統(tǒng)的識別方法很難鑒定，普通消費者更是無法區(qū)分和識別，這給消費者造成了巨大的經(jīng)濟損失，也給林業(yè)檢查和海關(guān)人員的識別工作增加了難度 [28]。 在本次研究中，為了驗證國際生命條形碼聯(lián)盟推薦的 MatK， trnHpsbA，ITS2 三個候選條形碼對降香黃檀分子條形碼測定的有效性，用特異性引物對降香黃檀 DNA 進行 PCR 擴增，擴增成功的 DNA 片段用于進一步測序分析，測序成功的條形碼片段可用于降香黃檀的研究鑒定。以 PCR 擴增成功率和測序成功率初步評價候選 DNA 條形碼片段，為今后利用 DNA 條形碼鑒定木材和構(gòu)建木材分子條形碼數(shù)據(jù)庫提供理論依據(jù)。 2 材料與方法 材料 基地種植的降香黃檀，采摘樹葉提取的 DNA 作為實驗模板。 試劑藥品 瓊脂糖， TAE， Goldview,TaKaRa Ex Taq， 610 Loading Buffer， dNTP Mixture，滅菌 ddH2O， AL2021 MarKer。 主要儀器設(shè)備 電子天平；量筒；燒杯； PCR 儀；凝膠成像系統(tǒng)；高速冷凍離心機；低溫冰箱；移液槍（ eppendprf： ； 10181。L； 20181。L； 50181。L； 100181。L）；移液管；微波爐；紫外分光光度計（ NanoDrop ND1000）；渦旋儀（ IKA）；恒溫搖床；電泳儀、電泳槽；恒溫水浴鍋；恒溫培養(yǎng)箱；超凈工作臺；手掌型離心機 。 實驗步驟 條形碼片段的 PCR 擴增 （ 1） 擴增引物 特異性的 PCR 擴增也同樣要求引物的特異性，產(chǎn)物的特異性程度依賴于擴增引物和模板的互補程度。在本次研究中采用的引物長度為 20 至 23，降香黃檀 DNA 條形碼序列測定 4 4 GC 的含量為 40%60%，且沒有連續(xù)排列的 5 個堿基 [29]。引物名稱和序列見表 1。 表 1 候選條形碼片段的擴增引物 Table1. Primers for each candidate barcoding sequences amplification 擴增片段 Target segments 引 物名稱 Primer name 引物序列 5’3’ Primer sequence 5’3’ MatK M1 CGATCTATTCATTCAATATTTC(22) M2 TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT(22) trnHpsbA T1 GTTATGCATGAACGTAATGCTC(22) T2 CGCGCATGGTGGATTCACAATCC(23) ITS I1 ATGCCTCAATCCAGAGAGACCC(22) I2 TAGCCCCGCCTGACCTGAG(19) （ 2） PCR 反應體系 采用 25μL反應體系，各反應成分： TaKaRa Ex Taq， 610 Lodaing Buffer， 2μL dNTP Mixture， 1μL上游引物， 1μL下游引物， 1μL DNA模板，加入 17μL滅菌 ddH2O 至總體系 25μL。 （ 3） PCR 反應條件 降香黃檀 DNA 條形碼序列測定 5 5 表 2 候選條形碼片段的 PCR 反應條件 conditions for candidate barcoding sequences 擴增片段 PCR 反應條件 MatK 94℃ 4min ， 94℃ 1 min， 48℃ 1 min， 72℃ 1 min， 30 cycles 72℃ 7 min trnHpsbA 94℃ 1 min， 94176。C 1 min,℃ 45s， 72℃ 1 min， 30 cycles 72℃ 7 min ITS2 94℃ 4 min 94℃ 1 min， ℃ 1 min， 72℃ 1min， 30 cycles 72℃ 7 min 配置 25μL反應體系，用 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本 DNA，左邊第一孔用移液槍注入 5μL AL2021 做對照。取 1μL 610 Lod aing Buffer， 5μL樣本 DNA 混合點樣于膠孔中。設(shè)置電泳儀 U=120V， I=220mA， 25 分鐘后取出凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈源下觀察 PCR 產(chǎn)物條帶。 條形碼片段的純化與檢測 （ 1） 條形碼片段的純化 采用天根柱式核酸純化試劑盒純化 PCR 產(chǎn)物（根據(jù)電泳檢測結(jié)果靈活確定待純化條形碼片段的 PCR 量）。 ① 在紫外燈源下，用鋒利的手術(shù)刀片將單一的目的條形碼 PCR 產(chǎn)物條帶切下，置于滅 菌離心管中，并稱重。 ② 取 500μL平衡液 BL 活化 CA2 吸附柱。 ③ 按所切下的產(chǎn)物凝膠質(zhì)量，加入 3 倍體積溶膠液 PN。 ④ 50℃ 水浴 10min，期間上下顛倒數(shù)次，確保膠塊充分溶解。若依舊有未溶膠塊，補加適量溶膠液或延長水浴時間，直至膠塊完全溶解。 降香黃檀 DNA 條形碼序列測定 6 6 ⑤ 待冷卻至室溫的膠塊溶解液 加入一個吸附柱 CA2 中，室溫放置 2min，13000*g 離心力離心 45s，丟棄流出液。 ⑥ 加入 600μL漂洗液 PW 到吸附柱 CA2 中， 13,000*g 離心力離心 1min。丟棄流出液，將吸附柱 CA2 放入收集管中。重復本操作一次。 ⑦ 將吸附柱 CA2 放置收集管中， 14000*g 離心 2min，除盡漂洗液。 ⑧ 室溫放置吸附柱 CA25min，徹底地晾干，避免殘留的漂洗液對下一步的實驗造成影響。 ⑨ 將吸附柱 CA2 置于一個干凈離心管中，加入 35μLddH2O()到吸附膜中間位置，室溫放置 2min。 13000*g 離心 2 min 收集 DNA 流出液。 ⑩ 將離心所得溶液重新加回吸附柱中，室溫放置 2min， 13000*g 再次離心 2min，得到純化后的條形碼 PCR 產(chǎn)物。 （ 2） 電泳檢測純化后的條形碼 PCR 產(chǎn)物 用 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的條形碼 PCR 產(chǎn)物。取 5μL AL2021 做對照 ,取 5μL純化產(chǎn)物與 1μL 610 Lodaing Buffer 混合后，點樣于凝膠孔中，設(shè)置電泳儀 U=120V， I=220mA， 25 分鐘后取出凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈源下觀察 PCR 產(chǎn)物條帶。 克隆 （ 1） 純化產(chǎn)物低溫連接 于超凈工作臺上吸取 4181。L 純化后的條形碼 PCR 產(chǎn)物、 1181。L T Vector 和連接液 SolutionⅠ 至同一 PCR 管中，輕彈管壁，使各組混合均勻，用手掌型離心機快速離心，集中溶液，然后置 PCR 管于 PCR 儀上， 16℃ 連接 20min。反應結(jié)束后將離心管置于冰上。 （ 2） 大腸桿菌轉(zhuǎn)化 ① 在超凈工作臺上，取 50181。L 感受態(tài)細胞并同時加入 5181。L 連接產(chǎn)物 (在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入鏈接產(chǎn)物 )，輕彈混勻后于冰中 30min； ② 結(jié)束后， 42℃ 水浴，熱激 30S，迅速再次冰浴 2min； ③ 向混合液離心管中加入 250181。L 滅菌 LB 培養(yǎng)基（不含氨芐青 霉素），混合均勻后，于震蕩培養(yǎng)箱 37℃ 200 轉(zhuǎn) /min 震蕩培養(yǎng) 1h，可使得大腸桿菌復蘇； ④ 取 80181。L 2mg/mlIPTG 和 40mg/mlXgal 混合，并均勻地涂布在準備好的平降香黃檀 DNA 條形碼序列測定 7 7 板上，在 37℃ 培養(yǎng)箱中放置 30min； ⑤ 待 IPTG 和 Xgal 被吸收后，取 200181。L 菌液均勻地涂在平板上，在 37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)（為得到更多的克隆， 4000 轉(zhuǎn) /min 離心 1m