【文章內(nèi)容簡介】 世代抗病性的影響。不同抗性的親本所配的不同組合及世代抗性不同的原因可能是因為存在著與抗性相關的生理生化性狀的差異 。傳統(tǒng)的大白菜白斑病的鑒定方法時間較長，且對環(huán)境條件要求較嚴格，主要根據(jù)肉眼觀察植株的癥狀，人為的規(guī)定病情指數(shù)，來決定植株的抗病程度，這樣往往也會出現(xiàn)一定的誤差。通過找出與大白菜抗白斑病相關的生理生化性狀，就可以在苗期分析這些性狀，以此來鑒定抗白斑病的能力，克服了室內(nèi)人工控制接種鑒定方法的不足。同時，通過生理生化分析將會不斷揭示植物抗白斑病的內(nèi)在原因。通過生理生化性狀分析，間接鑒定大白菜品種對白斑病的抗性，為生理生化育種奠定理論基礎。李春燕等人對大白菜抗白斑病的生理生化相關性狀進行研究，采用 4 個大白菜高代自 交系（ 2 個高抗親本， 2 個感病親本），按照 Griffing 雙列雜交遺傳交配設計方法配制 F。全部材料進行苗期人工接種抗病性鑒定。其中用 4 個親本進行了性狀相關分析及篩選，用 P， F來研究抗病性及其相關的生理生化的規(guī)律。結果表明過氧化氫酶活性同抗病性呈極顯著負相關，可溶性糖、谷氨酸、丙氨酸、精氨酸同抗病性達到極顯著正相關。過氧化氫酶活性同抗病性呈極顯著負相關的主要原因是過氧化氫在氧化酶的作用下能夠氧化成食子酚、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、對苯二酚等，而酚類又可氧化成醌類，醌類毒性很強，能鈍化病原物的呼吸酶，阻礙病原物的生長， 其次酚類化合物是細胞形成本質(zhì)素的前體，可形成木質(zhì)素，促進細胞壁木質(zhì)化，以抵抗病菌侵染，過氧化氫酶是催化分解過氧化氫反應的酶，因此它同抗病性呈極顯著負相關。氨基酸同抗病性達到極顯著正相關的主要原因是氨基酸同酚類化合物能發(fā)生縮合反應而形成對微生物有毒的產(chǎn)物，氨基酸對病原物的直接的抑制作用可能性不大，它可能是合成病原菌抑制劑的基礎物質(zhì)，尤其是谷氨酸，是合成許多氨基酸的前體，至于這 3種氨基酸是如何合成病原菌抑制劑的原理，還有待于進一步研究。 大白菜白斑病的遺傳研究進展 魏毓棠等 人 于 1988 年至 1990 年，采用 44 完全雙列雜交的方法，對大白菜苗期、成株期抗白斑病的遺傳變異規(guī)律進行了研究。研究表明大白菜抗白斑病菌的抗性受 4 對以上基因控制，為不完全顯性，回交效應顯著，正反交差異不顯著呈現(xiàn)核遺傳，細胞質(zhì)作用不顯著。一般配合力 ()和特殊配合力（ ）均較重要，符合 “ 加性 顯性 ” 模型，加性效應是主要的。這種抗性表現(xiàn)親代和子代間存在極顯著正相關，苗期人工接種鑒定和田間成株抗性鑒定發(fā)病趨勢一致的，呈現(xiàn)出數(shù)量性狀遺傳的特點。 引 言 5 大白菜白斑病 的 防治方法 （ 1）選用抗病品種。 大白菜品種對白班 病菌的抗性存在一定的差異，可選用抗病品種是防治大白菜白斑病的最經(jīng)濟有效的措施。防治白斑病的大白菜品種，可選用旱熟 5 號 (新株系 )、春夏王、改良青雜 3號、遼白 7號、吉研 5號、津綠 5津綠 7津綠 6綠星 70、天正秋白 1號、小青口、大青口、遼白 1號、疏心青白口等較抗病。 （ 2）清除初侵染源 種子消毒可用 50℃的溫水侵種 20min 后，移入冷水中冷卻，晾干播種 ?；蜻x用相當于種子重量 %的 25%瑞毒霉可濕性粉劑、 0. 4%的 7 5%百菌清可濕性粉劑拌種。收獲后，清潔田園，深翻曬上，把病株和病葉埋入上中，消滅過 冬菌源。 （ 3）加強栽培管理 科學管理肥、水。施足底肥，增施磷鉀肥。前期小水勤澆，中、后期穩(wěn)水、足水灌溉。追肥前重后輕，即蓮坐期每畝施碳銨 30 千克；包心中、后期，隨水帶肥，畝施碳銨 20 千克 。最后一次，隨水帶肥，畝施碳銨 5～ 10 千克。這樣，可促使植株生長健壯，增強抗病力。雨后注意排水，嚴防田間積水，并及時中耕松上 (到外葉封行不能動鋤為止 )，提高土壤溫度，抑制發(fā)病。 （ 4）農(nóng)業(yè)措施 實行輪作，與非十字花科蔬菜輪作 2～ 3年。采用高壟 (高 15～ 18cm)、短畦 (長 10m)栽培模式，適當遲播，切勿過旱搶種 ； 重發(fā)病區(qū)， 最好適當遲播。 （ 5）農(nóng)藥防治 防治白斑病，應從蓮坐期發(fā)病時 (病株率 5%～ 10%)開始打藥為好。噴施 25%嘧菌酯懸浮劑 1500 倍液或 40%多 .硫懸浮劑 600倍液或 50%多霉威可濕性粉劑 800 倍液、 65%甲硫霉威可濕性粉劑 1000倍液、 50%多菌靈可濕性粉劑 500倍液、 20%丙環(huán)唑微乳劑 3500倍液、 70%錳鋅乙鋁可濕性粉劑 500 倍液、 50%異菌脲可濕性粉劑 1000 倍液，或 50%多菌靈可濕性粉劑 +5%井岡霉素水劑 1： 700倍液，每 667沒噴藥液 5060L，間隔 15d左右1次，共防 23次。 分子標記技術 分子 標記 （ DNA 標記 ）是 遺傳標 記的一種類型， 可以明確反映基因組中任何座位上的相對差異的生物特征（方宣鈞等， 2021） 。 DNA 標記 是在 形態(tài)標記 （ morphological markers）、細胞學標記 （ cytological markers）和生化標記（ biochemical markers）之后產(chǎn)生的的一種較為理想的遺傳標記，它能直接反映植物 DNA 水平上的遺傳多態(tài)性，甚至可以區(qū)別單個核苷酸的差異， 是遺傳標記 上 的 一個 飛躍 。 DNA 分子 標記 對隱性農(nóng)藝性狀的選擇十分有利，主要表現(xiàn)在其不受 基因表達的影響，可在任何組織、任何發(fā)育階段進行檢測，而且大多數(shù)分子標記呈現(xiàn)共顯性。同時基因組 DNA 的變異非常豐富，分子標記的數(shù)量幾乎是無限的，而且所有生物的檢測程序基本一致。因此，分子標記技術的發(fā)展和應用為植物標記輔助育種提供了一東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學碩士學位論文 6 條嶄新的途徑。 分子標記與 傳統(tǒng)的 遺傳標記相比具有 很多 優(yōu) 點 ： ① 變異類型豐富，多態(tài)性高。 ② 不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖 ， 表現(xiàn)為 “中性” 。 ③ 數(shù)量極多，遍及整個基因組。 ④ 不受組織、器官、環(huán)境條件和發(fā)育時期的限制，具有很高的穩(wěn)定性，直接以 DNA 的形式表現(xiàn)。 ⑤ 許多分子標記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別純合基因型與雜合基因型。 廣義上講，分子標記包括兩類，即同工酶標記和 DNA 標記。狹義的分子標記僅指 DNA標記。 同工酶標記 同工酶是指催化同一反應而結構不同的一簇酶 ，是 一類底物相似或完全相同的酶分子形式。它們 既 由等位基因決定， 又 受到非等位基因的控制。前者稱為 “ 等位酶 ” 。 因 不同的同工酶形式在電荷和分子量等方面的 存在 差異， 采用 凝膠 電泳技術將它們分開， 在 專一的底物和特殊的染料染色 的情況下 ，在膠柱中 會出 現(xiàn)同工酶譜， 可以通過 光學掃描技術和相應的計算機分析軟件進行定量分析 它們的差異 。 鑒于 同工酶作為生物基因表達的產(chǎn)物， 其 受到嚴格的遺傳控制 ，因此 同工酶可以作為物種的遺傳標記， 其可應用在 物種和親緣關系的鑒定、新物種的尋找和開發(fā)、植物的發(fā)育生物學分析等方面，在分子標記的發(fā)展中起到重要作用（ 趙堅義 ， 1998） 。 同一生物的不同發(fā)育期會表現(xiàn)出不同的同工酶酶譜， 主要由于 同工酶是基因表達的產(chǎn)物，受到生物在發(fā)育過程中基因表達的時序控制，這 就會 給物種間關系的研 究造成了一定的干擾。 這就導致 同工酶分析在植物的研究上受到發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響，在研究中特別強調(diào)取材的一致性。 同工酶的應用受到一定的限制主要是同工酶 只能反映一部分功能基因（外顯子）的情況，而對大部分功能基因和大量非功能基因無法表現(xiàn) 。 因此在分子標記輔助育種、 QTL（數(shù)量性狀基因定位）制圖、遺傳多樣性 、 分子進化等需要大量標記的研究中，同工酶標記逐漸為 DNA 標記所取代。盡管如此，同工酶分子標記以其共顯性表達、重復性強，操作簡便等優(yōu)點使其仍在種群遺傳、分子進化、適應的分子基礎 、 功能基 因 的克隆等方面具有 DNA 標記所 不可替代的作用。 DNA 分子標記 1980 年興起的分子標記技術到目前已經(jīng)經(jīng)歷了 30 余年歷史，在這 30 余年中一些新的分子標記技術不斷問世，并被廣泛應用于各個研究領域。不同學者根據(jù)不同的分類標準，將分子標記技術分為不同的類型，如王斌（ 2021）以檢測技術和檢測對象為基礎將分子標記技術分為以傳統(tǒng)分子雜交技術為基礎、以 PCR 為基礎、以重復序列為基礎以及以 mRNA 為基礎的 4 種類型。王志林等（ 2021）把分子標記技術分為以分子雜交為基礎的，以 PCR 為基礎的和以芯片技術為基礎的 3 個類型；方宣鈞等（ 2021）依據(jù) DNA 多態(tài)性的檢測手段，將 DNA引 言 7 標記分為 4 大類：基于 DNADNA 雜交的 DNA 標記、基于單核苷酸多態(tài)性的 DNA 標記。盡管分類的依據(jù)不同，但各種分子標記技術都具有不同的特點，針對不同的研究目標，可以選用不同的分子標記技術，以達到高效和可靠的選擇目的。幾種常用的分子標記技術如下。 1） 限制性片 段 長度多態(tài)性標記 （ Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP） RFLP 技術是 Grodzicker 于 1974 年創(chuàng)立的， 是研究最早的分子標記技術， 具有重復性好、穩(wěn)定可靠、 標記數(shù)量多、呈共顯性標記等特點，已應用于遺傳育種、連鎖圖的構建、基因定位、數(shù)量性狀基因座分析、雜種優(yōu)勢遺傳成因剖析、資源評估、物種起源等方面的研究中。其 技術原理是基于限制性核酸內(nèi)切酶酶切消化核酸以及標記的 DNA 探針能與任何序列相似的片段雜交 ， 通過片段長度的變異檢測多態(tài)性。 由于 RFLP 但 RFLP 技術要制備探針，所需DNA 量大，使得操作過程復雜繁瑣，在很大程度上限制了 RFLP 技術的應用。 RFLP 技術在生物遺傳圖譜構建中得到了廣泛應用。 1987 年 Donis Keller 等構建出第一張人的 RFLP 圖譜。目前為止己 利用 RFLP 技術建立了果蠅、雞、鼠、牛、羊、豬、人等動物以及玉米、番茄、水稻、馬鈴薯、大麥、大豆、小麥等植物的連鎖圖譜（黃德娟， 1999；鄧儉英， 2021）。 2） 隨機擴增多態(tài)性 標記（ Random Amplified Polymorphic DNA， RAPD） RAPD 技術是 1990 年由 Williams 和 Welsh 領導的 2 個研究小組同時發(fā)展起來的建立在PCR 基礎上的一種新型 DNA 分子標記技術。它的基本原理是：采用隨機合成的寡核苷酸（通常 10bp）作 PCR 反應的引物，對所研究生物基因組 DNA 進行 PCR 擴增， 若引物在模板的兩條鏈上有互補位置，且與引物的 3′端相距一定范圍，就可擴增出 DNA 片段。如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生 DNA 片段的插入、缺失或突變，就可導致擴增片段呈多態(tài)性。擴增產(chǎn)物一般通過瓊脂糖電泳分離，經(jīng) EB 染色來檢測。 RAPD 標記是一種隨機引物的 PCR 標記， 具有技術簡單，檢測速度快， DNA 用量少，無需放射性分析 ， 也不會污染等 ， 不依賴于種屬特異性和基因組結構，一套引物可用于不同生物基因組分析，成本較低等獨特的優(yōu)點。 但 RAPD標記一般表現(xiàn)為顯性遺傳，不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型，因而提供的信息量不完整；另外，由于 使用了較短的引物， RAPD 標記的 PCR 易受環(huán)境條件的影響，結果的重復性較差。 3） 微衛(wèi)星標記（ Simple Sequence Repeats， SSR） 微衛(wèi)星 標記也 稱為簡單序列重復（ Simple Sequence Repeats， SSR），短串聯(lián)重復（ Short Tandem Repeats， STR）或簡單序列長度多態(tài)性（ Simple Sequence Length Polymorphism， SSLP） ，是一種特異引物的 PCR 標記。 SSR 的基本重復單元是由幾個核苷酸組成的，重復次數(shù)一般為 10~50（ Miyao， 2021） 。同一類微衛(wèi)星 DNA 可分布在基因組的不同位置上。由基本單元重復次數(shù)的不同形成 SSR 座位的多態(tài)性 （ Ramesh， 2021） 。每個 SSR 座位兩側一般是相對保守的單拷貝序列，因此可根據(jù)兩側序列設計一對特異引物來擴增 SSR 序列 （ Nicot， 2021） 。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴增帶的遷移距離，就可知不同個體在某個 SSR 座位上的多態(tài)性 （ 劉勛甲 ， 1998）。 SSR 標記以其穩(wěn)定、簡便、可靠的優(yōu)點 ， 被稱為第二代分子標記技術，有逐漸取代 RFLP東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學碩士學位論文 8 標記 的 趨勢。 SSR 標記具有以下一些優(yōu)點： ① 具有多等位基因的特性，提供的信息量高 ，一般檢測到的是一個單一多等位基因位點。 ② 所需 DNA 量少 ， 操作簡便快速 ， 費用低廉，結果 穩(wěn)定可靠。不像 RFLP 和 RAPD 那樣存在某種模糊性 （葉少平， 2021）。 ③ 數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài)性高 。 ④ 每個位點由設計的引物順序決定，便于不同的實驗室相互交流合作開發(fā)引物。 ⑤ 以孟德爾方式遺傳，呈共顯性 ， 故可鑒別雜合子和純合子。 與 SSR 技術原理相似的標記還有 ISSR，它是利 用同位素標記 SSR 序列，在引物的 5′和 3′端分別加入 1~2 個選擇性堿基，引物長度 16~18bp。 ISSR 通常為顯性標記呈孟德爾式遺傳，且有很好的多態(tài)性和穩(wěn)定性。 ISSR 技術所用的 PCR 引物長度在 20 個核 苷 酸左右，因此可以采用與常規(guī) PCR 相同的反應條件，穩(wěn)定性比 RAPD 好 （ Zietkiewicz， 1994）。 4）擴增片段長度多態(tài)性標記