【文章內(nèi)容簡介】 ； ④建立定期用消毒劑進行生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境消毒的車間環(huán)境衛(wèi)生制度。 （ 3）生產(chǎn)技術(shù)流程 農(nóng)用微生物菌劑的一般生產(chǎn)技術(shù)環(huán)節(jié)為：菌種→種子擴培 →發(fā)酵培養(yǎng)→后處理→包裝→產(chǎn)品質(zhì)量檢驗→出廠。流程圖見附錄 A。 菌種 （ 1）原種 原種是生產(chǎn)用菌種的母種，對原種的要求如下： ①有菌種鑒定報告； ②菌種的企業(yè)編號、來源等信息。 （ 2）菌種的保存和管理 ①采用合適的方式保存菌種，確保無雜菌污染，菌種不退化。應選用一種以上適宜的方法保藏，常見菌種類型及相應保藏方式見附錄B； ②分類存放，定期檢查； ③建立菌種檔案。 （ 3）菌種質(zhì)量控制 在生產(chǎn)之前，應對所用菌種進行檢查，確認其純度和應用性能沒有發(fā)生退化。出現(xiàn)污染或退化的菌種不能作 為生產(chǎn)用菌種，需進行（ 4） １６ 或（ 5）操作。 （ 4）菌種的純化 菌種不純時，應進行純化?？刹捎闷桨鍎澗€分離法或稀釋分離法，得到純菌種。必要時可采用顯微操作單細胞分離器進行菌種分離純化。對純化的菌種應進行生產(chǎn)性能的檢查。 （ 5）菌種的復壯 菌種發(fā)生下列現(xiàn)象之一，應進行菌種復壯： ①菌體形態(tài)及菌落形態(tài)發(fā)生變化； ②代謝活性降低，發(fā)酵周期改變； ③重要功能性物質(zhì)的產(chǎn)生能力下降； ④其他重要特性的退化或喪失； 菌種復壯方法：回接到原宿主或原分離環(huán)境傳代培養(yǎng)，重新分離該菌種。 發(fā)酵增殖 （ 1）種子擴培 原菌種應連續(xù)轉(zhuǎn)接活化至生長旺盛后方可應用。 種子擴培過程包括試管斜面菌種、搖瓶（或固體種子培養(yǎng)瓶）、種子罐發(fā)酵（或種子固體發(fā)酵）培養(yǎng)三個階段，操作過程要保證菌種不被污染、生長旺盛。 （ 2）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基重要原料應滿足一定的質(zhì)量要求，包括成分、含量、有效期以及產(chǎn)地等。對新使用的發(fā)酵原料需經(jīng)搖瓶試驗或小型發(fā)酵罐試驗 １７ 后方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。 ①種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基要保證菌種生長延滯期短，生長旺盛。原料應使用易被菌體吸收利用的碳、氮源，且氮源比例較高，營養(yǎng)豐富完全，有較強的 pH 緩沖能力。最后 一級種子培養(yǎng)基主要成分應接近發(fā)酵培養(yǎng)基。 ②發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后菌體生長旺盛，在保證一定菌體（或芽胞、孢子）密度的前提下兼顧有效代謝產(chǎn)物。原料應選用來源充足、價格便宜且易于利用的營養(yǎng)物質(zhì)，一般氮源比例較種子培養(yǎng)基低。 可采用對發(fā)酵培養(yǎng)基補料流加的方法改善培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成以達到高產(chǎn)。 （ 3）滅菌 常用的滅菌方式及適用對象見附錄 C。 ①高壓蒸汽滅菌操作要求 a) 液體培養(yǎng)基、補料罐（包括消泡劑）、管道、發(fā)酵設(shè)備及空氣過濾系統(tǒng)滅菌溫度為 121℃～ 125℃ (壓力 ～ )，～ 。液體培養(yǎng)基裝料量為 50%～ 75%發(fā)酵罐容積。 b) 固體培養(yǎng)基物料滅菌溫度為 121℃～ 130℃， ～ ；或采用 100℃滅菌 2h～ 4h， 24h 后再滅菌一次。 c) 在高溫滅菌會產(chǎn)生對菌體生長有害物質(zhì)或?qū)σ资芨邷仄茐奈锪蠝缇鷷r，應采用物料分別滅菌或降低滅菌溫度延長時間。 培養(yǎng)基滅菌后按②進行檢查。若滅菌不徹底，培養(yǎng)基不得使用。 １８ ②滅菌效果檢查 采用顯微鏡染色觀察法和 /或發(fā)酵管試驗法檢查培養(yǎng)基的滅菌效果。 Ⅰ染色觀察法 a) 對待檢測培養(yǎng)基無菌操作取樣，在潔 凈載玻片上涂片、染色、鏡檢。 b) 若鏡檢發(fā)現(xiàn)有菌體，即可認為滅菌不徹底，需要進行②操作，無活菌體后培養(yǎng)基方可使用。 c) 若未發(fā)現(xiàn)菌體，初步認為滅菌徹底，培養(yǎng)基可以使用。在必要時 ,可進行②操作，以進一步確認培養(yǎng)基滅菌徹底。 Ⅱ發(fā)酵管試驗法 用無菌操作技術(shù)將 1mL 供試培養(yǎng)基加至 5mL 已滅菌的營養(yǎng)肉湯中，重復三次。置于 37℃培養(yǎng)， 24h 內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體即可認為滅菌徹底。反之，即可判定培養(yǎng)基滅菌不徹底。 （ 4）無菌空氣 發(fā)酵生產(chǎn)中所通入的無菌空氣采用過濾除菌設(shè)備制得，空氣過濾系統(tǒng)應采用二級以上過 濾。對制得的無菌空氣按如下步驟檢驗合格后方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。 用無菌操作技術(shù)，向裝有 100mL～ 200mL 無菌肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中通入待監(jiān)測濾過空氣 10min～ 15min。三角瓶置于 37℃培養(yǎng)， 24h內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體即判定合格。 （ 5）發(fā)酵控制 １９ ①接種量的要求 搖瓶種子轉(zhuǎn)向種子發(fā)酵罐培養(yǎng)的接種量為 %～ 5%； 在多級發(fā)酵生產(chǎn)階段，對生長繁殖快的菌種（代時 3h），從一級轉(zhuǎn)向下一級發(fā)酵的接種量為 5%～ 10%；對生長繁殖較慢的菌種（代時 6h），接種量不低于 10%。 ②培養(yǎng)溫度 發(fā)酵溫度應控制 在 25℃～ 35℃，對特殊類型的菌種應根據(jù)其特性而定。在發(fā)酵過程中，可根據(jù)菌體的生長代謝特性在不同的發(fā)酵階段采用不同的溫度。 （ 6）供氧 通常采用的供氧方式是向培養(yǎng)基中連續(xù)補充無菌空氣，并與攪拌相配合，或者采用氣升式攪拌供氧。 對于好氧代謝的菌株或兼性厭氧類型菌株，培養(yǎng)基中的溶解氧不得低于臨界氧濃度；嚴格厭氧類型菌株培養(yǎng)基的氧化還原電位不得高于其臨界氧化還原電位。 （ 7）物料含水量 固體發(fā)酵初期適宜發(fā)酵的物料含水量為 50%～ 60%。發(fā)酵結(jié)束時，應控制在 20%～ 40%。 （ 8）發(fā)酵終點判斷 下列參 數(shù)為發(fā)酵終點判定依據(jù)： ①鏡檢觀察菌體的形態(tài)、密度 ,要求芽胞菌發(fā)酵結(jié)束時芽胞形成率≥ 80%； ２０ ②監(jiān)測發(fā)酵液中還原糖、總糖、氨基氮、 pH 值、溶解氧濃度、光密度及粘度等理化參數(shù)； ③監(jiān)測發(fā)酵過程中攝氧率、 CO2 產(chǎn)生率、呼吸熵、氧傳遞系數(shù)等發(fā)酵代謝特征參數(shù)； ④固體發(fā)酵中物料的顏色、形態(tài)、氣味、含水量等變化。 后處理 后處理過程可分為發(fā)酵物同載體（或物料）混合吸附和發(fā)酵物直接分裝兩種類型。 （ 1）發(fā)酵物同載體 (或物料 )混合吸附對載體及物料的要求如下： ①載體的雜菌數(shù)≤ 104 個 / g； ②細度、有毒有害元素（ Hg、 Pb、 Cd、 Cr、 As）含量、 pH、糞大腸菌群數(shù)、蛔蟲卵死亡率值達到產(chǎn)品質(zhì)量標準要求； ③有利于菌體（或芽胞、孢子）的存活； ④發(fā)酵培養(yǎng)物與吸附載體需混合均勻，可添加保護劑或采取適當措施，減少菌體的死亡率。吸附和混合環(huán)節(jié)應注意無菌控制 ,避免雜菌污染。 （ 2）發(fā)酵物直接分裝 對于發(fā)酵物直接分裝的產(chǎn)品劑型，可根據(jù)產(chǎn)品要求進行包裝。 建立生產(chǎn)檔案 每批產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗結(jié)果應存檔記錄，包括檢驗項目、檢驗結(jié)果、檢驗人、批準人、檢驗日期等信息。 產(chǎn)品 質(zhì)量跟蹤 ２１ 定期檢查產(chǎn)品質(zhì)量，并對產(chǎn)品建立應用檔案，跟蹤產(chǎn)品的應用情況。 該產(chǎn)品國內(nèi)外的生產(chǎn)能力、產(chǎn)量情況和變化趨勢 美國從 20 世紀 70 年代開始使用飼用微生態(tài)制劑 ,生產(chǎn)此類產(chǎn)品的公司較多 ,主要菌種是嗜酸乳桿菌、鏈球菌屬和枯草芽孢桿菌 ,其產(chǎn)品標簽上明確注明所含的活的天然微生物來源以及活的微生物數(shù)量保證值 。 此外 ,美國還有多種活菌制劑出售 ,主要用于犢牛育成及育肥期 ,其次為仔豬、母豬及火雞等方面 。 在日本使用菌株最多的是Toyi 菌 ,其次為酪酸菌及雙歧菌 ,也有多種菌的復合制劑 ,主要用于防治畜禽腸道菌病 和促進畜禽的生長發(fā)育及增重 。 在歐洲 ， 僅法國20 世紀 90 年代初市場上銷售的益生菌品種就不低于 50 個 ， 德國、荷蘭、丹麥、法國、西班牙等的大中型配合飼料廠和大型畜牧場目前都已開始對畜禽直接飼用微生物制劑 ,如仔豬的人工乳及犢牛的代用乳、肉犢牛的飼料以及肉用雞、兔飼料等 。 目前 ,國外很多生物技術(shù)公司已研制出豬用、禽用、牛用、伴侶動物用等多種微生態(tài)制劑 。 同時 ,國外在應用微生物飼料添加劑生產(chǎn)流體生物飼料方面 ,產(chǎn)業(yè)化發(fā)展也非常迅速 。 丹麥、荷蘭、英國、美國等目前已逐步推廣這一技術(shù) 。 從技術(shù)角度來看 ,國外采用液體發(fā)酵 ,有效 解決了產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、有效活菌數(shù)不足、產(chǎn)品雜菌污染等問題 ,并采用低溫真空干燥和微囊包被技術(shù) ,極大地改變了肉制品產(chǎn)品外觀質(zhì)量粗糙、貨架時間短的狀況。 鄭州后羿制藥有限公司以自主研發(fā)為主，同時同國內(nèi)各大科研機 ２２ 構(gòu)和高校展開合作，形成擁有自主知識產(chǎn)權(quán)技術(shù)。在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上，通過不同微生物和微生物組合來提高動物的生理健康；不同菌株之間體外生長和體內(nèi)繁殖的競爭生態(tài)關(guān)系來提高菌劑活力。 產(chǎn)品價格分析 微生態(tài)為系列產(chǎn)品主要有普通型和精品型兩種，普通型市場價每噸為 60008000 元，精品型市場價每噸為 57 萬元，普 通型成本每噸約為 2021 元，每噸純利為 6500 元，精品型每噸成本價約為 萬元，每月利潤約均 萬元，每月生產(chǎn)銷售約 60 噸，每月普通型利潤約為 39 萬元 ,精品型約為 175 萬元，年利潤約普通型 468 萬元，精品型約為 2100 萬元。 產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用及影響 當前發(fā)展畜牧業(yè)主要存在四大問題：一是飼料安全問題；二是飼料成本問題；三是防病抗病問題；四是環(huán)境污染問題。 （ １ ） 飼料安全問題主要存在在四個方面 一是違規(guī)使用激素和鎮(zhèn)靜劑；二是爛用抗生素；三是礦物質(zhì)飼料和微量元素嚴重超標；四是飼料原料中所含的有毒 有害物質(zhì)嚴重超標等。 （ ２ ） 飼料成本問題 一是精飼料緊缺（如豆粕、玉米、魚粉等），價格高昂；二是廉價的粗飼料（農(nóng)作物秸稈和雜餅等）卻無法利用而大量廢棄燒毀，制造環(huán)境災難。 我國有 13 億人口，每年的糧食總產(chǎn)量約 5 億噸，其中用作飼料 ２３ 的糧食就達 億噸以上。而且隨著人們生活水平的提高，對肉、蛋、奶的需求不斷增長，勢必促進畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。要發(fā)展畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)，就勢必發(fā)展飼料業(yè)，飼料業(yè)的發(fā)展，就必須增加飼料原料的供給。這樣一來，飼養(yǎng)業(yè)與人爭糧食的問題，不但沒有解決，而且還有加劇的可能。 我國秸稈飼料資 源非常豐富，各種可飼用的秸稈、藤蔓、牧草總量達 6 億噸以上。秸稈中含有植物光合作用積累的一半以上的能量，分布廣泛，競爭性用途少，開發(fā)應用前途很大。開發(fā)秸稈飼料可以節(jié)省飼料成本 3050%，是受廣大養(yǎng)殖戶歡迎的 。 （ 3） 防病抗病問題 人類與疾病作斗爭從 19 世紀末到現(xiàn)在經(jīng)歷了三個階段： 第一階段為治療醫(yī)學階段 治療醫(yī)學把動物比作機器，機器壞了就要修理；動物生病了就要治療。要治療就必須使用相關(guān)的藥物，特別是使用抗生素。這一階段也是抗生素發(fā)明和逐漸應用普及的階段。 第二階段為預防醫(yī)學階段 后來人們發(fā) 現(xiàn)，機器壞了不修理，則不能自然修復，而動物生病了不吃藥不打針卻可以 “ 自然康復 ” ，說明動物有一種 “ 自然免疫力 ” 。從 19 世紀末到 20 世紀初，人們從許多的啟發(fā)中，發(fā)明了 “ 疫苗和菌苗 ” ，用于疾病的預防，于是動物醫(yī)學由治療醫(yī)學階段發(fā)展到了預防醫(yī)學階段。 第三階段為保健醫(yī)學階段 又叫生態(tài)醫(yī)學階段 ， 后來人們發(fā)現(xiàn)了抗生素的三大弱點：一是抗生素在消滅病原微生物的同時，也消滅了動物體內(nèi)的有益微生物，破壞了微生態(tài)平衡，導致更多的感染和更大 ２４ 的疾病；二是抗生素在動物體內(nèi)殘留和富集，通過食物鏈，直接威脅著人類的健康和生命安全；三是 抗生素的長期使用，引起致病微生物產(chǎn)生耐藥性和耐藥菌株，導致今天許多疾病已經(jīng)無藥可治，如五號病、瘋牛病、禽流感等等。 （ 4） 環(huán)境污染問題 專家們測試表明：動物將飼料中的養(yǎng)份轉(zhuǎn)化成畜產(chǎn)品的效率只有20— 35％， 6580％的攝入養(yǎng)份都排入了環(huán)境，對土壤、水源和空氣造成了巨大污染，其中以氮、磷及銅、鋅、硒等微量元素和抗生素的污染最為嚴重 ?? 環(huán)境污染是世界性的大難題?，F(xiàn)在人們治理環(huán)境污染的方法主要有三種：即物理法（沉淀和過濾）、化學法和生物法（如活性污泥法），但都投資過大，成本過高，速度太慢，不堪重負。好 的方法 “ 有 ” ，但還有待菌種創(chuàng)新和工藝創(chuàng)新。 所以利用微生物技術(shù)，解決飼養(yǎng)業(yè)的上述重大問題，提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益勢在必 行。 第五章 項目建設(shè)方案 項目的產(chǎn)能概況 項目前期主要針對微生物生態(tài)菌劑在使用中的問題，以單胃動物豬和禽類雞為代表，系統(tǒng)研究不同微生物菌劑對動物胃酸、膽液、胰液的抵抗能力，在腸道中的生存、定植和繁殖問題。 不同微生物和微生物組合對動物的生理健康和增重的影響；主要菌株之間體外生長和體內(nèi)繁殖的競爭生態(tài)關(guān)系；研究了優(yōu)化的微生物 ２５ 菌劑組合對動物免疫系統(tǒng)影響和對仔豬下痢和 雞白痢的預防治療作用。得到了大量有價值數(shù)據(jù)和規(guī)律，篩選到大量有價值微生物和微生物組合，對菌劑的配伍組合規(guī)律有了更為深入的認識。 在實際產(chǎn)品的生產(chǎn)應用中，菌劑活力的保持也甚為重要。為此，我們對菌體的保護劑進行了研究，開發(fā)出了一套低成本保持菌體存活率的方法，在常溫下可保持全部菌體在較高水平半年以上。 同時菌劑的制粒干燥工藝也是造成菌體死亡的關(guān)鍵工藝步驟。針對這一問題，對部分菌株不耐高溫菌株，開發(fā)了一套低