【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ； ④建立定期用消毒劑進(jìn)行生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境消毒的車(chē)間環(huán)境衛(wèi)生制度。 （ 3）生產(chǎn)技術(shù)流程 農(nóng)用微生物菌劑的一般生產(chǎn)技術(shù)環(huán)節(jié)為：菌種→種子擴(kuò)培 →發(fā)酵培養(yǎng)→后處理→包裝→產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)→出廠。流程圖見(jiàn)附錄 A。 菌種 （ 1）原種 原種是生產(chǎn)用菌種的母種，對(duì)原種的要求如下： ①有菌種鑒定報(bào)告； ②菌種的企業(yè)編號(hào)、來(lái)源等信息。 （ 2）菌種的保存和管理 ①采用合適的方式保存菌種，確保無(wú)雜菌污染，菌種不退化。應(yīng)選用一種以上適宜的方法保藏，常見(jiàn)菌種類(lèi)型及相應(yīng)保藏方式見(jiàn)附錄B； ②分類(lèi)存放，定期檢查； ③建立菌種檔案。 （ 3）菌種質(zhì)量控制 在生產(chǎn)之前，應(yīng)對(duì)所用菌種進(jìn)行檢查，確認(rèn)其純度和應(yīng)用性能沒(méi)有發(fā)生退化。出現(xiàn)污染或退化的菌種不能作 為生產(chǎn)用菌種，需進(jìn)行（ 4） １６ 或（ 5）操作。 （ 4）菌種的純化 菌種不純時(shí)，應(yīng)進(jìn)行純化?？刹捎闷桨鍎澗€分離法或稀釋分離法，得到純菌種。必要時(shí)可采用顯微操作單細(xì)胞分離器進(jìn)行菌種分離純化。對(duì)純化的菌種應(yīng)進(jìn)行生產(chǎn)性能的檢查。 （ 5）菌種的復(fù)壯 菌種發(fā)生下列現(xiàn)象之一，應(yīng)進(jìn)行菌種復(fù)壯： ①菌體形態(tài)及菌落形態(tài)發(fā)生變化； ②代謝活性降低，發(fā)酵周期改變； ③重要功能性物質(zhì)的產(chǎn)生能力下降； ④其他重要特性的退化或喪失； 菌種復(fù)壯方法：回接到原宿主或原分離環(huán)境傳代培養(yǎng)，重新分離該菌種。 發(fā)酵增殖 （ 1）種子擴(kuò)培 原菌種應(yīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接活化至生長(zhǎng)旺盛后方可應(yīng)用。 種子擴(kuò)培過(guò)程包括試管斜面菌種、搖瓶（或固體種子培養(yǎng)瓶）、種子罐發(fā)酵（或種子固體發(fā)酵）培養(yǎng)三個(gè)階段，操作過(guò)程要保證菌種不被污染、生長(zhǎng)旺盛。 （ 2）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基重要原料應(yīng)滿(mǎn)足一定的質(zhì)量要求，包括成分、含量、有效期以及產(chǎn)地等。對(duì)新使用的發(fā)酵原料需經(jīng)搖瓶試驗(yàn)或小型發(fā)酵罐試驗(yàn) １７ 后方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。 ①種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基要保證菌種生長(zhǎng)延滯期短，生長(zhǎng)旺盛。原料應(yīng)使用易被菌體吸收利用的碳、氮源，且氮源比例較高，營(yíng)養(yǎng)豐富完全，有較強(qiáng)的 pH 緩沖能力。最后 一級(jí)種子培養(yǎng)基主要成分應(yīng)接近發(fā)酵培養(yǎng)基。 ②發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后菌體生長(zhǎng)旺盛，在保證一定菌體（或芽胞、孢子）密度的前提下兼顧有效代謝產(chǎn)物。原料應(yīng)選用來(lái)源充足、價(jià)格便宜且易于利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一般氮源比例較種子培養(yǎng)基低。 可采用對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)料流加的方法改善培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成以達(dá)到高產(chǎn)。 （ 3）滅菌 常用的滅菌方式及適用對(duì)象見(jiàn)附錄 C。 ①高壓蒸汽滅菌操作要求 a) 液體培養(yǎng)基、補(bǔ)料罐（包括消泡劑）、管道、發(fā)酵設(shè)備及空氣過(guò)濾系統(tǒng)滅菌溫度為 121℃～ 125℃ (壓力 ～ )，～ 。液體培養(yǎng)基裝料量為 50%～ 75%發(fā)酵罐容積。 b) 固體培養(yǎng)基物料滅菌溫度為 121℃～ 130℃， ～ ；或采用 100℃滅菌 2h～ 4h， 24h 后再滅菌一次。 c) 在高溫滅菌會(huì)產(chǎn)生對(duì)菌體生長(zhǎng)有害物質(zhì)或?qū)σ资芨邷仄茐奈锪蠝缇鷷r(shí)，應(yīng)采用物料分別滅菌或降低滅菌溫度延長(zhǎng)時(shí)間。 培養(yǎng)基滅菌后按②進(jìn)行檢查。若滅菌不徹底，培養(yǎng)基不得使用。 １８ ②滅菌效果檢查 采用顯微鏡染色觀察法和 /或發(fā)酵管試驗(yàn)法檢查培養(yǎng)基的滅菌效果。 Ⅰ染色觀察法 a) 對(duì)待檢測(cè)培養(yǎng)基無(wú)菌操作取樣，在潔 凈載玻片上涂片、染色、鏡檢。 b) 若鏡檢發(fā)現(xiàn)有菌體，即可認(rèn)為滅菌不徹底，需要進(jìn)行②操作，無(wú)活菌體后培養(yǎng)基方可使用。 c) 若未發(fā)現(xiàn)菌體，初步認(rèn)為滅菌徹底，培養(yǎng)基可以使用。在必要時(shí) ,可進(jìn)行②操作，以進(jìn)一步確認(rèn)培養(yǎng)基滅菌徹底。 Ⅱ發(fā)酵管試驗(yàn)法 用無(wú)菌操作技術(shù)將 1mL 供試培養(yǎng)基加至 5mL 已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，重復(fù)三次。置于 37℃培養(yǎng)， 24h 內(nèi)無(wú)渾濁、鏡檢無(wú)菌體即可認(rèn)為滅菌徹底。反之，即可判定培養(yǎng)基滅菌不徹底。 （ 4）無(wú)菌空氣 發(fā)酵生產(chǎn)中所通入的無(wú)菌空氣采用過(guò)濾除菌設(shè)備制得，空氣過(guò)濾系統(tǒng)應(yīng)采用二級(jí)以上過(guò) 濾。對(duì)制得的無(wú)菌空氣按如下步驟檢驗(yàn)合格后方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。 用無(wú)菌操作技術(shù)，向裝有 100mL～ 200mL 無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中通入待監(jiān)測(cè)濾過(guò)空氣 10min～ 15min。三角瓶置于 37℃培養(yǎng)， 24h內(nèi)無(wú)渾濁、鏡檢無(wú)菌體即判定合格。 （ 5）發(fā)酵控制 １９ ①接種量的要求 搖瓶種子轉(zhuǎn)向種子發(fā)酵罐培養(yǎng)的接種量為 %～ 5%； 在多級(jí)發(fā)酵生產(chǎn)階段，對(duì)生長(zhǎng)繁殖快的菌種（代時(shí) 3h），從一級(jí)轉(zhuǎn)向下一級(jí)發(fā)酵的接種量為 5%～ 10%；對(duì)生長(zhǎng)繁殖較慢的菌種（代時(shí) 6h），接種量不低于 10%。 ②培養(yǎng)溫度 發(fā)酵溫度應(yīng)控制 在 25℃～ 35℃，對(duì)特殊類(lèi)型的菌種應(yīng)根據(jù)其特性而定。在發(fā)酵過(guò)程中，可根據(jù)菌體的生長(zhǎng)代謝特性在不同的發(fā)酵階段采用不同的溫度。 （ 6）供氧 通常采用的供氧方式是向培養(yǎng)基中連續(xù)補(bǔ)充無(wú)菌空氣，并與攪拌相配合，或者采用氣升式攪拌供氧。 對(duì)于好氧代謝的菌株或兼性厭氧類(lèi)型菌株，培養(yǎng)基中的溶解氧不得低于臨界氧濃度；嚴(yán)格厭氧類(lèi)型菌株培養(yǎng)基的氧化還原電位不得高于其臨界氧化還原電位。 （ 7）物料含水量 固體發(fā)酵初期適宜發(fā)酵的物料含水量為 50%～ 60%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，應(yīng)控制在 20%～ 40%。 （ 8）發(fā)酵終點(diǎn)判斷 下列參 數(shù)為發(fā)酵終點(diǎn)判定依據(jù)： ①鏡檢觀察菌體的形態(tài)、密度 ,要求芽胞菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)芽胞形成率≥ 80%； ２０ ②監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中還原糖、總糖、氨基氮、 pH 值、溶解氧濃度、光密度及粘度等理化參數(shù)； ③監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中攝氧率、 CO2 產(chǎn)生率、呼吸熵、氧傳遞系數(shù)等發(fā)酵代謝特征參數(shù)； ④固體發(fā)酵中物料的顏色、形態(tài)、氣味、含水量等變化。 后處理 后處理過(guò)程可分為發(fā)酵物同載體（或物料）混合吸附和發(fā)酵物直接分裝兩種類(lèi)型。 （ 1）發(fā)酵物同載體 (或物料 )混合吸附對(duì)載體及物料的要求如下： ①載體的雜菌數(shù)≤ 104 個(gè) / g； ②細(xì)度、有毒有害元素（ Hg、 Pb、 Cd、 Cr、 As）含量、 pH、糞大腸菌群數(shù)、蛔蟲(chóng)卵死亡率值達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求； ③有利于菌體（或芽胞、孢子）的存活； ④發(fā)酵培養(yǎng)物與吸附載體需混合均勻，可添加保護(hù)劑或采取適當(dāng)措施，減少菌體的死亡率。吸附和混合環(huán)節(jié)應(yīng)注意無(wú)菌控制 ,避免雜菌污染。 （ 2）發(fā)酵物直接分裝 對(duì)于發(fā)酵物直接分裝的產(chǎn)品劑型，可根據(jù)產(chǎn)品要求進(jìn)行包裝。 建立生產(chǎn)檔案 每批產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)存檔記錄，包括檢驗(yàn)項(xiàng)目、檢驗(yàn)結(jié)果、檢驗(yàn)人、批準(zhǔn)人、檢驗(yàn)日期等信息。 產(chǎn)品 質(zhì)量跟蹤 ２１ 定期檢查產(chǎn)品質(zhì)量，并對(duì)產(chǎn)品建立應(yīng)用檔案，跟蹤產(chǎn)品的應(yīng)用情況。 該產(chǎn)品國(guó)內(nèi)外的生產(chǎn)能力、產(chǎn)量情況和變化趨勢(shì) 美國(guó)從 20 世紀(jì) 70 年代開(kāi)始使用飼用微生態(tài)制劑 ,生產(chǎn)此類(lèi)產(chǎn)品的公司較多 ,主要菌種是嗜酸乳桿菌、鏈球菌屬和枯草芽孢桿菌 ,其產(chǎn)品標(biāo)簽上明確注明所含的活的天然微生物來(lái)源以及活的微生物數(shù)量保證值 。 此外 ,美國(guó)還有多種活菌制劑出售 ,主要用于犢牛育成及育肥期 ,其次為仔豬、母豬及火雞等方面 。 在日本使用菌株最多的是Toyi 菌 ,其次為酪酸菌及雙歧菌 ,也有多種菌的復(fù)合制劑 ,主要用于防治畜禽腸道菌病 和促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育及增重 。 在歐洲 ， 僅法國(guó)20 世紀(jì) 90 年代初市場(chǎng)上銷(xiāo)售的益生菌品種就不低于 50 個(gè) ， 德國(guó)、荷蘭、丹麥、法國(guó)、西班牙等的大中型配合飼料廠和大型畜牧場(chǎng)目前都已開(kāi)始對(duì)畜禽直接飼用微生物制劑 ,如仔豬的人工乳及犢牛的代用乳、肉犢牛的飼料以及肉用雞、兔飼料等 。 目前 ,國(guó)外很多生物技術(shù)公司已研制出豬用、禽用、牛用、伴侶動(dòng)物用等多種微生態(tài)制劑 。 同時(shí) ,國(guó)外在應(yīng)用微生物飼料添加劑生產(chǎn)流體生物飼料方面 ,產(chǎn)業(yè)化發(fā)展也非常迅速 。 丹麥、荷蘭、英國(guó)、美國(guó)等目前已逐步推廣這一技術(shù) 。 從技術(shù)角度來(lái)看 ,國(guó)外采用液體發(fā)酵 ,有效 解決了產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、有效活菌數(shù)不足、產(chǎn)品雜菌污染等問(wèn)題 ,并采用低溫真空干燥和微囊包被技術(shù) ,極大地改變了肉制品產(chǎn)品外觀質(zhì)量粗糙、貨架時(shí)間短的狀況。 鄭州后羿制藥有限公司以自主研發(fā)為主，同時(shí)同國(guó)內(nèi)各大科研機(jī) ２２ 構(gòu)和高校展開(kāi)合作，形成擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)技術(shù)。在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上，通過(guò)不同微生物和微生物組合來(lái)提高動(dòng)物的生理健康；不同菌株之間體外生長(zhǎng)和體內(nèi)繁殖的競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)關(guān)系來(lái)提高菌劑活力。 產(chǎn)品價(jià)格分析 微生態(tài)為系列產(chǎn)品主要有普通型和精品型兩種，普通型市場(chǎng)價(jià)每噸為 60008000 元，精品型市場(chǎng)價(jià)每噸為 57 萬(wàn)元，普 通型成本每噸約為 2021 元，每噸純利為 6500 元，精品型每噸成本價(jià)約為 萬(wàn)元，每月利潤(rùn)約均 萬(wàn)元，每月生產(chǎn)銷(xiāo)售約 60 噸，每月普通型利潤(rùn)約為 39 萬(wàn)元 ,精品型約為 175 萬(wàn)元，年利潤(rùn)約普通型 468 萬(wàn)元，精品型約為 2100 萬(wàn)元。 產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用及影響 當(dāng)前發(fā)展畜牧業(yè)主要存在四大問(wèn)題：一是飼料安全問(wèn)題；二是飼料成本問(wèn)題；三是防病抗病問(wèn)題；四是環(huán)境污染問(wèn)題。 （ １ ） 飼料安全問(wèn)題主要存在在四個(gè)方面 一是違規(guī)使用激素和鎮(zhèn)靜劑；二是爛用抗生素；三是礦物質(zhì)飼料和微量元素嚴(yán)重超標(biāo)；四是飼料原料中所含的有毒 有害物質(zhì)嚴(yán)重超標(biāo)等。 （ ２ ） 飼料成本問(wèn)題 一是精飼料緊缺（如豆粕、玉米、魚(yú)粉等），價(jià)格高昂；二是廉價(jià)的粗飼料（農(nóng)作物秸稈和雜餅等）卻無(wú)法利用而大量廢棄燒毀，制造環(huán)境災(zāi)難。 我國(guó)有 13 億人口，每年的糧食總產(chǎn)量約 5 億噸，其中用作飼料 ２３ 的糧食就達(dá) 億噸以上。而且隨著人們生活水平的提高，對(duì)肉、蛋、奶的需求不斷增長(zhǎng)，勢(shì)必促進(jìn)畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。要發(fā)展畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)，就勢(shì)必發(fā)展飼料業(yè)，飼料業(yè)的發(fā)展，就必須增加飼料原料的供給。這樣一來(lái)，飼養(yǎng)業(yè)與人爭(zhēng)糧食的問(wèn)題，不但沒(méi)有解決，而且還有加劇的可能。 我國(guó)秸稈飼料資 源非常豐富，各種可飼用的秸稈、藤蔓、牧草總量達(dá) 6 億噸以上。秸稈中含有植物光合作用積累的一半以上的能量，分布廣泛，競(jìng)爭(zhēng)性用途少，開(kāi)發(fā)應(yīng)用前途很大。開(kāi)發(fā)秸稈飼料可以節(jié)省飼料成本 3050%，是受廣大養(yǎng)殖戶(hù)歡迎的 。 （ 3） 防病抗病問(wèn)題 人類(lèi)與疾病作斗爭(zhēng)從 19 世紀(jì)末到現(xiàn)在經(jīng)歷了三個(gè)階段： 第一階段為治療醫(yī)學(xué)階段 治療醫(yī)學(xué)把動(dòng)物比作機(jī)器，機(jī)器壞了就要修理；動(dòng)物生病了就要治療。要治療就必須使用相關(guān)的藥物，特別是使用抗生素。這一階段也是抗生素發(fā)明和逐漸應(yīng)用普及的階段。 第二階段為預(yù)防醫(yī)學(xué)階段 后來(lái)人們發(fā) 現(xiàn)，機(jī)器壞了不修理，則不能自然修復(fù)，而動(dòng)物生病了不吃藥不打針卻可以 “ 自然康復(fù) ” ，說(shuō)明動(dòng)物有一種 “ 自然免疫力 ” 。從 19 世紀(jì)末到 20 世紀(jì)初，人們從許多的啟發(fā)中，發(fā)明了 “ 疫苗和菌苗 ” ，用于疾病的預(yù)防，于是動(dòng)物醫(yī)學(xué)由治療醫(yī)學(xué)階段發(fā)展到了預(yù)防醫(yī)學(xué)階段。 第三階段為保健醫(yī)學(xué)階段 又叫生態(tài)醫(yī)學(xué)階段 ， 后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)了抗生素的三大弱點(diǎn)：一是抗生素在消滅病原微生物的同時(shí)，也消滅了動(dòng)物體內(nèi)的有益微生物，破壞了微生態(tài)平衡，導(dǎo)致更多的感染和更大 ２４ 的疾??；二是抗生素在動(dòng)物體內(nèi)殘留和富集，通過(guò)食物鏈，直接威脅著人類(lèi)的健康和生命安全；三是 抗生素的長(zhǎng)期使用，引起致病微生物產(chǎn)生耐藥性和耐藥菌株，導(dǎo)致今天許多疾病已經(jīng)無(wú)藥可治，如五號(hào)病、瘋牛病、禽流感等等。 （ 4） 環(huán)境污染問(wèn)題 專(zhuān)家們測(cè)試表明：動(dòng)物將飼料中的養(yǎng)份轉(zhuǎn)化成畜產(chǎn)品的效率只有20— 35％， 6580％的攝入養(yǎng)份都排入了環(huán)境，對(duì)土壤、水源和空氣造成了巨大污染，其中以氮、磷及銅、鋅、硒等微量元素和抗生素的污染最為嚴(yán)重 ?? 環(huán)境污染是世界性的大難題?，F(xiàn)在人們治理環(huán)境污染的方法主要有三種：即物理法（沉淀和過(guò)濾）、化學(xué)法和生物法（如活性污泥法），但都投資過(guò)大，成本過(guò)高，速度太慢，不堪重負(fù)。好 的方法 “ 有 ” ，但還有待菌種創(chuàng)新和工藝創(chuàng)新。 所以利用微生物技術(shù)，解決飼養(yǎng)業(yè)的上述重大問(wèn)題，提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益勢(shì)在必 行。 第五章 項(xiàng)目建設(shè)方案 項(xiàng)目的產(chǎn)能概況 項(xiàng)目前期主要針對(duì)微生物生態(tài)菌劑在使用中的問(wèn)題，以單胃動(dòng)物豬和禽類(lèi)雞為代表，系統(tǒng)研究不同微生物菌劑對(duì)動(dòng)物胃酸、膽液、胰液的抵抗能力，在腸道中的生存、定植和繁殖問(wèn)題。 不同微生物和微生物組合對(duì)動(dòng)物的生理健康和增重的影響；主要菌株之間體外生長(zhǎng)和體內(nèi)繁殖的競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)關(guān)系；研究了優(yōu)化的微生物 ２５ 菌劑組合對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)影響和對(duì)仔豬下痢和 雞白痢的預(yù)防治療作用。得到了大量有價(jià)值數(shù)據(jù)和規(guī)律，篩選到大量有價(jià)值微生物和微生物組合，對(duì)菌劑的配伍組合規(guī)律有了更為深入的認(rèn)識(shí)。 在實(shí)際產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)用中，菌劑活力的保持也甚為重要。為此，我們對(duì)菌體的保護(hù)劑進(jìn)行了研究，開(kāi)發(fā)出了一套低成本保持菌體存活率的方法，在常溫下可保持全部菌體在較高水平半年以上。 同時(shí)菌劑的制粒干燥工藝也是造成菌體死亡的關(guān)鍵工藝步驟。針對(duì)這一問(wèn)題，對(duì)部分菌株不耐高溫菌株，開(kāi)發(fā)了一套低