20xx年單域抗體的研究和應(yīng)用進(jìn)展(編輯修改稿)
2025-01-26 00:37 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 檢測(cè)到明顯的富集效果。 （3） 抗體的表達(dá)純化， 將目的抗體基因序列克隆到表達(dá)載體上， 可以通過原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。
基于酵母表面展示技術(shù)的單域抗體篩選
酵母屬于真核的單細(xì)胞生物， 用于抗體展示技術(shù)的酵母一般是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae, 這種酵母有大約200 nm厚的細(xì)胞壁， 出芽的酵母細(xì)胞壁表面有凝集素蛋白， 可以與相對(duì)交配型的酵母上的Aga2p蛋白結(jié)合， 單域抗體便是以融合蛋白的形式與Aga2p蛋白融合表達(dá)并展示于酵母細(xì)胞表面[1820].
酵母展示抗體庫的篩選方法一般采用磁珠輔助的細(xì)胞分選 （MACS） 和流式細(xì)胞分選 （FACS） , MACS的主要作用是為了減少非特異性結(jié)合， 通常會(huì)在MACS篩選過后的基礎(chǔ)上進(jìn)行多輪的FACS進(jìn)行篩選[20,21].
相比于噬菌體展示技術(shù)， 酵母展示技術(shù)既有優(yōu)勢(shì)也有不足。一方面酵母屬于真核細(xì)胞， 抗體的翻譯后修飾與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似， 糖基化后的抗體穩(wěn)定性高， 同時(shí)也避免在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中可能存在的未知情況。其次酵母展示技術(shù)采用的是流式細(xì)胞分選的方法， 整個(gè)篩選過程的可控性更高[16].但另一方面酵母抗體庫的庫容一般比噬菌體抗體庫的小， 最高到110, CFU, 但隨著技術(shù)的優(yōu)化， 已有報(bào)道酵母抗體庫的庫容可以提高到10CFU水平[22], ， 因?yàn)槊恳粋€(gè)酵母細(xì)胞上會(huì)同時(shí)展示110到110個(gè)抗體片段[20], 因此一個(gè)酵母細(xì)胞可能同時(shí)共價(jià)結(jié)合多個(gè)抗原， 這樣便會(huì)導(dǎo)致篩選到的抗體的親和力可能不如預(yù)期。
基于細(xì)菌展示技術(shù)的單域抗體篩選
大腸埃希氏菌Escherichia coli除了用于噬菌體文庫的構(gòu)建外， 其本身也可以作為抗體展示的載體。， 除了有細(xì)菌內(nèi)膜， 在細(xì)胞壁外還有一層細(xì)菌外膜。， 通過抗體的Fc段與膜上的脂蛋白結(jié)合， 這種展示和表達(dá)方式稱為Anchored periplasmic expression （APEx、錨定周質(zhì)表達(dá)） .， 因此細(xì)菌需要通透處理成原生質(zhì)球的形式才能與抗原結(jié)合[2324].利用外膜展示抗體的技術(shù)也有被報(bào)道過， 例如Salema等將抗體片段展示在Eha A autotransporter （自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白） 或Intimin （緊密黏附素） 上， O157:H7 （EHEC） 細(xì)菌的外膜， K12細(xì)菌中表達(dá)和展示[2527].革蘭氏陽性菌中的肉葡萄球菌Staphylococcus carnosus也可以用于抗體展示， 該方法是通過肉葡萄球菌的staphylococcal protein A蛋白的細(xì)胞壁錨定區(qū)域 （Cellwall anchoring domain） 將抗體片段從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到膜外并錨定在細(xì)胞壁上[28].細(xì)菌展示技術(shù)的篩選方法一般采用流式細(xì)胞分選 （FACS） 的方式， 同時(shí)也會(huì)結(jié)合磁珠輔助的細(xì)胞分選 （MACS） .
3 單域抗體的應(yīng)用
單域抗體在顯微鏡學(xué)中的應(yīng)用
因?yàn)閱斡蚩贵w體積小， 已經(jīng)有許多研究證實(shí)了將單域抗體帶上標(biāo)簽后， 可以用作納米級(jí)的檢測(cè)工具。例如， 針對(duì)GFP和RFP等熒光蛋白的單域抗體在標(biāo)記上有機(jī)染料后可用于超分辨率顯微鏡成像[2930].在2020年， Ries J等利用該方法對(duì)穩(wěn)定表達(dá)tubulinYFP的Ptk2細(xì)胞進(jìn)行成像， 并最終將分辨率提高到 （177。） nm （細(xì)胞微管蛋白的直徑為25 nm） [29], 而如果用傳統(tǒng)的抗體， 分辨率只能達(dá)到45 nm左右。Chamma等將GFP的單域抗體應(yīng)用于活細(xì)胞成像和雙色熒光成像系統(tǒng)。他們利用單域抗體去活體標(biāo)記軸突蛋白1β， 然后用雙色成像系統(tǒng)去觀察神經(jīng)細(xì)胞間的跨突觸連接[31].GFP和RFP的單域抗體還可以用于研究亞細(xì)胞上的超微結(jié)構(gòu)， 例如核孔復(fù)合物和胞膜窖， 與間接的抗體免疫化學(xué)方法不同， 利用單域抗體染色可以更好的模擬這些超微結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況[3233].
單域抗體用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究
單域抗體結(jié)合抗原可以穩(wěn)定抗原的結(jié)構(gòu)， 并且單域抗體本身分子量小， 對(duì)抗原的影響小， 所以單域抗體被用于穩(wěn)定一些結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的蛋白， 輔助解析蛋白的結(jié)構(gòu)。G蛋白偶聯(lián)受體GPCRs （G protein coupled receptors） 是一肽類膜蛋白受體的簡(jiǎn)稱， 是最著名的藥物靶標(biāo)分子。它參與了很多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程， 可以調(diào)節(jié)人體許多生理學(xué)機(jī)能。相同的GPCRs可以結(jié)合不同親和力的激動(dòng)劑分子， 并激活不同的下游信號(hào)通路。為了更好地理解不同的激動(dòng)劑分子為何可以激活相同的受體， GPCRs的晶體結(jié)構(gòu)解析是非常重要的手段。β2adrenoceptor （β2AR、β2腎上腺素受體） 是GPCRs的成員， 它可以被許多天然激動(dòng)劑， 如腎上腺素 （Adrenaline） 等低親和力地結(jié)合并激活， 但不穩(wěn)定。β2AR也可以和BI167107 （Boehringer Ingelheim） 等商品化激動(dòng)劑高親和力地結(jié)合并維持穩(wěn)定的激活狀態(tài)。G蛋白可以通過與β2AR結(jié)合并增強(qiáng)其與激動(dòng)劑之間的親和力。Nb80是一株來源于美洲駝 （llama） 的單域抗體， 它可以與β2AR結(jié)合并表現(xiàn)出和G蛋白一樣的性質(zhì)[3435].Soren （第3個(gè)胞內(nèi)環(huán)被替換成T4溶菌酶） 結(jié)合形成的復(fù)合物β2ART4LNb80成功地解析了BI167107激活下的β2AR晶體結(jié)構(gòu)， ?[34].之后， Aaron ， 并成功得到了一株Nb6B9抗體， ?, 同時(shí)也解析了hydroxybenzyl isoproterenol （HBI、羥芐基異丙腎上腺素） 和adrenaline這兩類低親和力激動(dòng)
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