【正文】 化酶的作用下，催化 S腺苷甲硫氨酸（ SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。由于 R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。 同裂酶（ isoschizomers) 指來源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。 羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。 它作用的底物可以是具有 3’ OH末端的單鏈DNA,也可以是具有 3’ OH突出末端的雙鏈 DNA 用途： 1. 催化 [α 32P]3’ 脫氧核苷酸標(biāo)記 DNA片斷的3’ 末端。 影響連接酶作用的因素 1. 反應(yīng)溫度： 連接缺口的溫度： 37度 連接 粘性末端 的最佳溫度： 4～ 15度 ４ ＤＮＡ連接酶的用量： 平末端 DNA分子的連接反應(yīng)中，最適 1～ 2個(gè)單位。 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。 DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件： 底物： 四種脫氧核苷 5’ 三磷酸（ dNTP）； Mg＋＋ 離子 ； 帶有 3’ OH游離基團(tuán)的引物鏈； DNA模板：?jiǎn)捂?，雙鏈（ 糖 磷酸主鍵上有一個(gè) 或多個(gè)斷裂 ）。 DNA片斷末端標(biāo)記： 具有 3’隱蔽末端的帶標(biāo)記得的 DNA片斷 5’ GATCT…3 ’ 3’ A…5 ’ 在反應(yīng)物中加入 Klenow聚合酶 α 32pdGTP,一道溫育后生成： 5’ GATCT…3 ’ 3’ 32p GA…5 ’ 或是同時(shí)加入 α 32pdATP＋ dGTP 5’ GATCT…3 ’ 3’ 32p AGA…5 ’ DNA片斷末端標(biāo)記可以作為用凝膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。 T7DNA聚合酶： 1978年， T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來的一種核酸酶。 2023年 1月 上午 11時(shí) 49分 :49January 23, 2023 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 11:49:0511:49:0511:49Monday, January 23, 2023 1知人者智，自知者明。 上午 11時(shí) 49分 5秒 上午 11時(shí) 49分 11:49: 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 11:49:0511:49:0511:49Monday, January 23, 2023 1乍見翻疑夢(mèng)，相悲各問年。 主要作用是以 mRNA為模板合成 cDNA；用來對(duì) 5’突出末端的 DNA片斷作末端標(biāo)記。 低濃度的 32pdNTPs（ 2 μmol/L ）和高濃度的 dNTPs（ 20 μmol/L ） 一般希望有 30%左右的 32pdNTPs參入 DNA鏈（ DnaseＩ數(shù)量）。 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ： 1957年，美國(guó)的生物學(xué)家 次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種 DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的 DNA聚合酶Ｉ。 Hpa II Hpa II BamH I 或 Sau3A 銜接物（ linker） 是指用化學(xué)方法合成的一段由 10～ 12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。而且被連接的 DNA鏈必須是雙螺旋 DNA分子的一部分。 局部酶切消化： 不讓核酸內(nèi)切限制酶對(duì)大量的DNA消化完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片斷產(chǎn)物，進(jìn)行不完全的限制酶消化反應(yīng)。 限制酶的特性 DNA的來源無關(guān)； （對(duì)某種限制酶只具一個(gè)限制位點(diǎn)的質(zhì)粒）。 核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式 粘性末端 ：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的 DNA片斷。 ?R/M體系： 寄主是由兩種酶活性配合完成的 一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶 另一種是核酸內(nèi)切限制酶 EcoB核酸酶和 EcoB甲基化酶 當(dāng) λ(k) 噬菌體侵染 ，由于其 DNA中有 EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。 ? 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： Ⅰ 型酶、 Ⅱ 型酶、 Ⅲ 型酶 Ⅰ 型酶： 1968年， 。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。 例： EcoR I: 來自于 Escheria coli RY13的第一個(gè)限制酶。可用于測(cè)序的終止，一位不含游離的3’ OH末端。 粘性末端 DNA片斷之間的連接，酶濃度 。 粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。 DNA聚合酶Ｉ 5’ 3’的核酸外切酶活性 5’ 3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上； 切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距 5’末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生； DNA的合成可以增強(qiáng) 5’ 3’的核酸外切酶活性； 5’ 3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及 3’ 5’的水解作用位點(diǎn)是分開的。因?yàn)楸粯?biāo)記的 DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關(guān)。 具有 5’ 3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的 3’ 5’核酸外切酶活性。 2023年 1月 23日星期一 11時(shí) 49分 5秒 11:49:0523 January 2023