【正文】 特異的核酸外切酶處理 DNA片斷 在 A和 B分別中加入 dATP和 dTTP 同聚物尾巴 10~40個堿基 同聚物加尾法或 T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，獲得插入片斷進行進一步的研究。 DNA連接酶對具有粘性末端的 DNA分子經退火后能很好地連接 ， 對平末端的 DNA分子也可以進行連接 ， 但連接效率較低 ， 必須加大酶的用量 。 反轉錄酶（ reverse transcriptase） 這類酶來自于反轉錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。 它不需要模板，可以用含有的 3’ OHＤＮＡ片段為引物，在 3’ OH端加入核苷酸達幾百個。 2. TrisHCl ： 維持最適的 pH值（ pH ＝ ）。 其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。 一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。不易重新環(huán)化。 ? 識別位點是一個回文對稱結構，并且切割位點也在這一回文對稱結構上。 R/M體系的作用： 保護自身的 DNA不受限制； 破壞外源 DNA使之迅速降解 ? 限制性內切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制?；蚬こ痰拿笇W基礎 限制性核酸內切酶 ＤＮＡ連接酶 DNA聚合酶 限制性核酸內切酶 （ restriction endonuclease） 。 EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。反應只需Mg++的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應用。 Pst1 EcoR1 5’ CTGCAG 3’ 5’ GAATTC 3’ 3’ GACGTC 5’ 3’ CTTAAG 5’ 平末端 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的 DNA片斷。 雜種位點（ hybrid site）：由一對同尾酶分別產生的粘性末端共價結合形成的位點。 第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。 核酸內切限制酶標準的緩沖液 1. 氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀： 不正確的 NaCl或 Mg++濃度，會降低限制酶的活性，還可能導致識別序列的改變。 真核生物基因組 的消化作用 小分子量的片斷 少 （電泳 容易分離目的片斷） 大分子量的片斷 多（基因文庫 ） ＤＮＡ連接酶（ DNA ligase）與分子的體外連接 末端核苷酸轉移酶（ terminal transferase） terminal deoxynucleotidyl transferase），它是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質，在二甲胂酸緩沖液中，能催化 5’脫氧核苷三磷酸進行 5’－ 3’方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性 DNA分子的 3’ OH末端。 S1核酸酶： 來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結構的處理。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來。 平末端 DNA片斷的連接 1. T4DNA連接酶 2. 用 末端核苷酸轉移酶 給平末端加上同聚物尾巴之后，再用 DNA連接酶連接。 銜接物連接法 雙銜接物連接法的基本程序 cDNA鏈的合成 通過 DNA聚合酶合成第二鏈 加入 Sal I銜接物 S I核酸酶作用后的末端單鏈突出序列， 由 Klenow補齊，加入第二銜接物 Ecol I 在用 DNA銜接物連接法時，如果待克隆 DNA的片斷或基因內部，含有與所加銜接物相同的限制位點，在酶切消化銜接物產生粘性末端的同時，也會把克隆的基因切斷。 1. 寡核苷酸連接測定 2. （ oligonucletide ligation assay,OLA） 3. 用兩個寡核苷酸探針，同已知序列的靶 DNA雜交，探針在靶 DNA分子的位置是相鄰的。 DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個片斷，一個具有全部的 3’ 5’的外切酶活性和 5’ 3’ 的聚合酶活性，另一個具有全部 5’ 3’的外切酶活性。 DNA缺口轉移（ nick translation） 在 DNA分子的單鏈缺口上， DNA聚合酶Ｉ的 5’ 3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。仍具有 5’ 3’的聚合酶活性和 3’ 5’ 的外切酶活性，失去了全酶的 5’ 3’ 外切酶活性。 在沒有脫氧核苷三磷酸存在的情況下， 3’外切酶活性便是 T4 DNA聚合酶的獨特功能。 用堿水解法除去 mRNA模板，單鏈 cDNA能自我折疊形成一種發(fā)夾結構，作第二鏈的引物，用反轉錄酶或 Klenow聚合酶催化第二鏈 cDNA的合成； 用 SＩ核酸內切酶消化除去單鏈區(qū)的發(fā)夾結構。 制備探針； 可催化較低水平的 dNTP （ μmol/L ）參入。 2023年 1月 23日星期一 上午 11時 49分 5秒 11:49: 1比不了得就不比，得不到的就不要。 11:49:0511:49:0511:49Monday, January 23, 2023 1不知香積寺，數里入云峰。 11:49:0511:49:0511:491/23/2023 11:49:05 AM 1越是沒有本領的就越加自命不凡。 上午 11時 49分 5秒 上午 11時 49分 11:49: MOMODA POWERPOINT Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blandit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis ut cursus. 感 謝 您 的 下 載 觀 看 專家告訴