【正文】 he chosen structure as free energy minimum. 蛋白質(zhì)創(chuàng)造和改造 ? 蛋白質(zhì)的改造，從物理、化學(xué)法到基因重組。 ? 佩里（ Perry） 1984年溶菌酶分子改造使酶熱穩(wěn)定性提高。 ? 蛋白質(zhì)工程將蛋白質(zhì)與酶的研究推進(jìn)到嶄新的時(shí)代，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用開(kāi)拓了誘人的前景。 ?物理、化學(xué)法：對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性、復(fù)性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團(tuán)，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進(jìn)蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等等； ?生物化學(xué)法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學(xué)基團(tuán)，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等。 ? 1999年， Stemmer等把 DNA改組延伸到族改組。 ? 微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合 ， 將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選。 特點(diǎn) 改組基因的效率高 提高基因突變機(jī)率 基因家族改組 隨機(jī)引物體外重組法 (RPR) 交錯(cuò)延伸原理 DNA改組與常規(guī)定向進(jìn)化的比較 基因文庫(kù)的構(gòu)建 ? 構(gòu)建理想的基因文庫(kù)要考慮的因素： ? 基因文庫(kù)的質(zhì)量 ? (1) 文庫(kù)的代表性 ? (2) 突變基因片段的序列完整性 ? 文庫(kù)篩選可選擇的方法 ? 控制突變庫(kù)的大小與特定的篩選容量相適應(yīng) 突變體基因的構(gòu)建策略 ? DNA隨機(jī)酶切，片段拼接 ? 單鏈 DNA隨機(jī)拼接（提高不同親代基因的同源片段重組形成嵌合體基因的效率） ? 限制性酶切片段隨機(jī)拼接（防止 PCR擴(kuò)增產(chǎn)生相同的親代基因） 構(gòu)建突變基因文庫(kù)的載體系統(tǒng) ? 噬菌體載體系統(tǒng)基因文庫(kù)： ?構(gòu)建中最早使用 ?插入片段的裝載容量大，適合大片段克隆 ?構(gòu)建出的基因文庫(kù)質(zhì)量高、代表性好 ?適合長(zhǎng)期保存 ?主要缺點(diǎn)是構(gòu)建成基因文庫(kù)后，可采用的文庫(kù)篩選方法有限 質(zhì)粒載體系統(tǒng) ? 質(zhì)粒載體系統(tǒng)： ? 優(yōu)點(diǎn) ?體外操作簡(jiǎn)便， ?載體本身的設(shè)計(jì)上有很大可塑性 ?能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因文庫(kù)的功能性篩選 ? 缺點(diǎn) ?插入片段的載體容量較小，含有長(zhǎng)片段的重組克隆在文庫(kù)的群體擴(kuò)增過(guò)程中容易丟失 ?轉(zhuǎn)化效率普遍較低 ?不適合文庫(kù)的長(zhǎng)期保存 文庫(kù)的篩選 ? 建立有效的搜索文庫(kù)的方法是影響定向進(jìn)化成功與否的關(guān)鍵 ? 采用的定向篩選方法必須靈敏，且應(yīng)與目的性質(zhì)相關(guān) ? 借助檢測(cè)儀器易實(shí)現(xiàn)高通量篩選 定向進(jìn)化的篩選 ? 活體篩選法 基于表形觀察的篩選 ? 基于基因編碼蛋白質(zhì)的檢測(cè)篩選表達(dá)文庫(kù) ? 噬菌體顯示法； ? 細(xì)胞表面顯示法（細(xì)菌、纖毛蟲(chóng)細(xì)胞表面