【正文】 hern印跡有兩點(diǎn)根本的區(qū)別： (1)印跡的對(duì)象不同：Northern是RNA，Southern是DNA；(2)電泳條件不同，前者是變性條件，后者是非變性條件。 (a)只與完全相同的片段 (b)可與任何含有相同序列的DNA片段 (c)可與任何含有互補(bǔ)序列的DNA片段’． (d)可與用某些限制性內(nèi)切核酸酶切成的DNA片段 (e)以上都是52． 用下列方法進(jìn)行重組體的篩選，只有( )說明外源基因進(jìn)行了表達(dá)。5．當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí)，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?為什么?注意星活性，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一 種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星活性。12． 如何將野生型的l噬菌體改造成為一個(gè)理想的載體? (1)削減分子量(除去非必需區(qū)和整合區(qū))； (2)削減酶切位點(diǎn)； (3)添加選擇標(biāo)記； (4)引入終止突變13． PCR的基本原理是什么?用PCR擴(kuò)增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息? (1)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。22． 你在做Southern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。四、問答題：1． 說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。C最好，這種溫度有利于末端退火和連接酶的活性穩(wěn)定。339。539。應(yīng)用： (1)dsDNA的539。一個(gè)多聚體是由多個(gè)單體相互連接而成的。該模型要解決的問題是質(zhì)膜上必須有許多獨(dú)特的位點(diǎn)以供不同的質(zhì)?？截惤Y(jié)合，這似乎不太可能。質(zhì)粒R1的殺手蛋白Hok,破壞細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的功能，引起細(xì)胞活力的喪失。主要是在l載體的非必要區(qū)插入一個(gè)帶有大腸桿菌b—半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的l載體轉(zhuǎn)入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷(Xgal)平板上形成淺藍(lán)色的噬菌斑?？寺〉淖畲笃卧?5kb，最小片段為19kb?；蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念。OH端逐個(gè)添加單個(gè)核苷酸。24．答： 由于基因已被測(cè)序并進(jìn)行了分析，因此前體mRNA結(jié)構(gòu)是已知的。它是將生長在或影印在微孔濾膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌，原位進(jìn)行DNA變性并原位固定在濾膜上，然后用放射性標(biāo)記的探針同固定了的DNA進(jìn)行雜交經(jīng)放射自顯影后，確定哪一個(gè)菌落含有重組的DNA分子，再從參比平板上選取重組體。問題是BamHI和KpnI的末端是不匹配的，BamHI是5’突出端，KpnI則是突出的3’ 端(圖22．7)。 (1)你如何看待第一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?對(duì)照1的目的是什么? (2)影響第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是什么?對(duì)照2的作用何在? (3)對(duì)照3和4各有什么作用? (4)為什么要用堿性磷酸酶處理載體? 表22．2 cDNA克隆的結(jié)果—————————————————————————制備的樣品 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 2 3————————————————————————— 對(duì)照1 只有細(xì)胞 TMTC 0 0對(duì)照2 未切的載體 TMTC 0 1000對(duì)照3 省去磷酸酶處理，無cDNA TMTC 0 435對(duì)照4 無cDNA TMTC 0 25實(shí)驗(yàn)樣品 TMTC 0 34————————————————————————— 注：TMTC=too many to count，多到無法計(jì)數(shù)。此外，如果蛋白質(zhì)序列短則可通過化學(xué)合成得到該基因。 (4)產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以被細(xì)菌的蛋白酶所識(shí)別和降解。 在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計(jì)數(shù)的菌落(表22．2)。 (3)探針只會(huì)與特定基因進(jìn)行堿基配對(duì)(雜交)，沖洗濾膜后，未結(jié)合上的標(biāo)記探針會(huì)被除去(圖A21．)。將待標(biāo)記的DNA片段同隨機(jī)引物一起進(jìn)行雜交，并以雜交體上的寡聚核苷酸為引物，在Klenow酶的作用下合成互補(bǔ)DNA鏈，當(dāng)反應(yīng)底物中有放射性的dNTP時(shí)，新合成的DNA就帶上了標(biāo)記。這樣用同裂酶進(jìn)行體外重組時(shí)，在限制性內(nèi)切核酸酶切割反應(yīng)之后不必將原有的內(nèi)切酶失活，就可直接進(jìn)行重組連接。這種方法的核心是利用末端轉(zhuǎn)移酶的功能，將核苷酸轉(zhuǎn)移到雙鏈DNA分子的突出或隱蔽的339。17．答： 基因文庫，或克隆文庫，是一群細(xì)菌克隆，每個(gè)克隆含有一個(gè)帶有某一供體生物不同DNA片段的質(zhì)?；蚴删w載體；這群克隆有95％99％的可能性使基因組DNA的每一片段至少存在于一個(gè)克隆中。14．答： 主要特點(diǎn)有： (1)具有質(zhì)粒復(fù)制子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并且能夠被氯霉素?cái)U(kuò)增。 (2)野生型的lDNA對(duì)于一些常用的酶都有多個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)，不便于克隆。像F質(zhì)粒、R1質(zhì)粒、以及P1噬菌體都有這種功能。在這個(gè)模型中，每一種質(zhì)粒都有它自己獨(dú)特的同質(zhì)膜結(jié)合的位點(diǎn)。末端，以便讓末端轉(zhuǎn)移酶加尾。 (3)其他的一些用途：包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點(diǎn)突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(primer extension)制備單鏈DNA探針等。用Klenow酶的切割反應(yīng)來修復(fù)339。339。 概括起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：(1)高甘油含量(5％, v／v)；(2)限制性 內(nèi)切核酸酶用量過高(100U／ugDNA)；(3)低離子強(qiáng)度(25 mmol／L)；(4)高pH(8．0 以上)；(5)含有有機(jī)溶劑，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二價(jià)陽離子存在(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。26．用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac+ Tet+的質(zhì)粒載體，已知該酶識(shí)別的是4個(gè)堿基序列， 并產(chǎn)生有兩個(gè)堿基突出的單鏈末端，該酶在lac基因內(nèi)有切割位點(diǎn)，并在第二個(gè)氨基 酸密碼子內(nèi)，該位點(diǎn)可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。(注：E．coli野生型的ThyA基因的序列是已知的)為了擴(kuò)增突變體的thyA基因，先設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中一個(gè)引物的序列與thyA基因的5’端相同，另一個(gè)引物同該基因的3’端互補(bǔ)。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時(shí)能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。3．在序列539。 端制備探針的描述中( )是不正確的。51．可用T4 DNA聚合酶進(jìn)行平末端的DNA標(biāo)記，因?yàn)檫@種酶具有__5’174。40．只要知道基因組中某一特定區(qū)域的部分核苷酸組成，用_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可以將這段DNA進(jìn)行百萬倍的擴(kuò)增。pUC系列的載體是通過pBR322和M13 兩種質(zhì)粒改造而來。外切酶的活性。2． 基因工程的兩個(gè)基本特點(diǎn)是： (1)分子水平上的操作，(2)細(xì)胞水平上的表達(dá)3． 基因克隆中三個(gè)基本要點(diǎn)是：克隆基因的類型；受體的選擇；載體的選擇4． 通過比較用不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小 的片段，可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點(diǎn)相互位置的限制性酶切圖譜。339。20．YAC的最大容載能力是1000kb，BAC載體的最大容載能力是 300kb 。37． DNA重組連接的方法大致分為四種：(1)黏性末端連接； (2)平末端連接；(3)同聚物接尾連接；(4)接頭連接法。48．差示雜交(differential hybridization)技術(shù)需要__兩種不同的細(xì)胞群體能夠表達(dá)不同的基因，即在一個(gè)群體中能夠表達(dá)一些基因，而在另一個(gè)細(xì)胞群體中不能表達(dá)這些基因。在下列文庫中， ( )屬cDNA文庫 (a) YAC文庫 (b) MAC文庫 (c) 扣減文庫 (d) BAC文庫40．下面關(guān)于多克隆位點(diǎn)(multiple clone site,MCS)的描述，不正確的—句是( ) (a)僅位于質(zhì)粒載體中 (b)具有多種酶的識(shí)別序列 (c)不同酶的識(shí)別序列可以有重疊 (d)一般是人工合成后添加到載體中41．在cDNA技術(shù)中，所形成的發(fā)夾環(huán)可用( ) (a)限制性內(nèi)切核酸酶切除 (b)用3185。如果分別用4種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會(huì)獲 得4組長度不同的DNA片段。聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～9倍，測(cè)序時(shí)常用此酶。20．欲將一真核生物的結(jié)構(gòu)基因克隆后轉(zhuǎn)移到原核生物(如E．coli)中進(jìn)行表達(dá)，克隆時(shí)應(yīng)注意哪些問題?應(yīng)注意的問題有：?jiǎn)?dòng)子、密碼子、剪接、分泌。 原因是：HindⅢ的切點(diǎn)在A基因內(nèi)。 順序號(hào)： 若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、… 等，用正體。聚合酶和339。突出末端則是用Klenow酶的339。不過這一反應(yīng)用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的339。不能切割帶切口或缺口的dsDNA。par位點(diǎn)是質(zhì)粒同質(zhì)膜結(jié)合的區(qū)域，在細(xì)胞分裂時(shí)，由于膜的生長，質(zhì)粒的兩個(gè)拷貝就被拉到兩個(gè)子細(xì)胞中?？赡苁窃鰪?qiáng)了質(zhì)粒分離后的迅速復(fù)制，防止了下次分裂時(shí)的丟失。(3)一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因?yàn)橹亟M后有可能給宿主帶來突變。 (3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。 輔助噬菌體必需具備如下條件： (1)助噬菌體的DNA IG區(qū)必需失去功能，其本身的DNA不會(huì)被包裝到成熟的噬菌體顆粒中； （2）由于輔助噬菌體的IG區(qū)失活，其本身的基因不能表達(dá)，要使輔助噬菌體的所有功能基因都能進(jìn)行表達(dá)，必須在輔助噬菌體的基因組中導(dǎo)人新的復(fù)制起點(diǎn)； (3)輔助噬菌體的基因組中具有選擇標(biāo)記，便于識(shí)別和收集一定數(shù)量的輔助噬菌體。cDNA文庫與基因組文庫的主要差別是： (1)基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因； (2)基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響； (3)基因組文庫中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而eDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因。23．答： 同裂酶是一類識(shí)別序列不完全相同，但是產(chǎn)生的黏性末端至少有四個(gè)堿基相同的限制性內(nèi)切核酸酶。27．答： 這一方法的基本原理是根據(jù)抗體、抗原分子的三個(gè)基本特性而設(shè)計(jì)的一種篩選鑒定重組體的方法。一個(gè)常用方法是雜交(圖A21．1)： (1)從不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纖維素濾膜上，然后用NaOH使之變性(圖 A21．)。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。 (2)大多數(shù)真核基因有內(nèi)含子，這些內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄后從前體mRNA中被切除而形成成熟mRNA。如果加工有困難，可以用合成基因，從而免除加工過程。這些帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)能夠緊緊地同Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脫。雖然寡聚核苷酸分子被限制性內(nèi)切核酸酶切割后會(huì)產(chǎn)生合適的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羥基。它首先用合適的限制性內(nèi)切核酸酶將DNA切割，進(jìn)行電泳分離后，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生毛細(xì)作用，使液體經(jīng)過凝膠，從而使DNA片段由液流攜帶從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在固體支持物表面。將擬南芥的基因組DNA或cDNA分別克隆到酵母人工染色體(YAC)上作為定位或篩選的融合標(biāo)簽，基因可以在酵母中作為細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)。(3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進(jìn)行連接。19．答： 同mRNA互補(bǔ)的DNA稱為cDNA。 黏粒載體也有如下不足：(1)如果兩個(gè)黏粒之間有同源序列，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果會(huì)使被克隆的片段重排或丟失。如果插入的外源DNA引起a肽的可讀框的改變，或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就會(huì)形成白色噬菌斑。如果一個(gè)細(xì)胞丟失了質(zhì)粒，既沒有毒性蛋白也沒有解毒劑的合成。染色體上有很多的位點(diǎn)，并且隨著DNA的復(fù)制而加倍，這些位點(diǎn)可供質(zhì)粒結(jié)合。為了避免這種情況的發(fā)生，很多質(zhì)粒都具有位點(diǎn)專一性重組的系統(tǒng)，可以破壞多聚體。 (2)DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。隱含末端，然后在高濃度的標(biāo)記底物( 32pdNTP)存在下，使降解(339?；?39。平末端連接時(shí)連接酶的濃度要比黏性末端連接時(shí)高10100倍。21．什么是同聚物加尾連接法(homopolymer tails joining)?用何種方法加尾?具有哪些優(yōu) 缺點(diǎn)?22．何謂接頭連接法(1inker ligation)?23．什么是同裂酶?為什么說用同裂酶進(jìn)行體外重組效率最高?24．為了大量獲得許多用于生化鑒定的產(chǎn)物，你想將擬南芥中的一個(gè)序列已知、編碼單 體酶蛋白的基因在單細(xì)胞微生物中表達(dá)，你如何確保最終能得到產(chǎn)物?25．某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgl I的切點(diǎn)。然后用標(biāo)記探針雜交，最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影片是空白。15． 怎樣將一個(gè)平末端DNA片段插入到EcoR I限制位點(diǎn)中去?化學(xué)合成一些長為10bp含有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會(huì)產(chǎn)生EcoRI的單鏈末端。539。末端標(biāo)記，可用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)T4DNA聚合酶 (d)T7DNA聚合酶答案1．c；2．c； 3．b； 4．b 5．b，C，d，e； 6．c； 7．b； 8