【正文】 H端逐個添加單個核苷酸。所以，cDNA文庫是不可能構(gòu)建得十分全，也就是說任何一個cDNA文庫都不可能包含某—生物全部編碼基因?；蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念。而輔助噬菌體具有M13的所有功能基因，但是IG區(qū)是缺陷的，輔助噬菌體本身的DNA不能進(jìn)行單鏈復(fù)制，于是就可以為噬菌粒提供基因2產(chǎn)物和包裝蛋白?？寺〉淖畲笃卧?5kb，最小片段為19kb。 (2)可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對于DNA測序、DNA誘變、制備特異的單鏈DNA探針都是十分有用的。主要是在l載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌b—半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的l載體轉(zhuǎn)入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷(Xgal)平板上形成淺藍(lán)色的噬菌斑。 (2)具有條件致死突變，如溫度敏感質(zhì)粒pJC307(ColEl的衍生質(zhì)粒)在哺乳動物正常體溫下就喪失復(fù)制能力，可防止克隆基因擴(kuò)散，只存在于限定的宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒R1的殺手蛋白Hok,破壞細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的功能，引起細(xì)胞活力的喪失。例如，質(zhì)粒pSCl01的par區(qū)可以增加質(zhì)粒的超螺旋，至于超螺旋的增加如何幫助質(zhì)粒的適當(dāng)分離是不清楚的。該模型要解決的問題是質(zhì)膜上必須有許多獨特的位點以供不同的質(zhì)?？截惤Y(jié)合，這似乎不太可能。 關(guān)于par位點是怎樣增強(qiáng)質(zhì)粒適當(dāng)分離的機(jī)制有兩種模型，按照這兩種模型，細(xì)菌的膜具有真核生物有絲分裂紡錘體的功能，在細(xì)胞分裂之前將質(zhì)粒分開。一個多聚體是由多個單體相互連接而成的。該酶雖然能切割單鏈DNA,但效率較低(下降200倍)。應(yīng)用： (1)dsDNA的539。這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng)(exchange／replacement reaction)。539。突出末端的反應(yīng)主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填補(bǔ)反應(yīng)；而修復(fù)339。339。339。C最好，這種溫度有利于末端退火和連接酶的活性穩(wěn)定。 第四字母： 若有株名，株名則作為第四字母，是否大小寫，根據(jù)原來的情況而定， 但用正體。四、問答題：1． 說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點。24．用EcoRI和Hind Ⅲ分別切割同一來源的染色體DNA，并進(jìn)行克隆，在前者的克隆中篩選到A基因，但在后者的克隆中未篩選到A基因，請說明原因。22． 你在做Southern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。19． Muller的PCR反應(yīng)同大腸桿菌體內(nèi)的DNA復(fù)制有哪些不同?你認(rèn)為根本的差別在 哪里? PCR用雙引物，體內(nèi)復(fù)制用單引物。12． 如何將野生型的l噬菌體改造成為一個理想的載體? (1)削減分子量(除去非必需區(qū)和整合區(qū))； (2)削減酶切位點； (3)添加選擇標(biāo)記； (4)引入終止突變13． PCR的基本原理是什么?用PCR擴(kuò)增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息? (1)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。339。5．當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?為什么?注意星活性，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一 種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星活性。羥基末 端，因此會終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行。 (a)只與完全相同的片段 (b)可與任何含有相同序列的DNA片段 (c)可與任何含有互補(bǔ)序列的DNA片段’． (d)可與用某些限制性內(nèi)切核酸酶切成的DNA片段 (e)以上都是52． 用下列方法進(jìn)行重組體的篩選，只有( )說明外源基因進(jìn)行了表達(dá)。35．關(guān)于cDNA的最正確的說法是：( ) (a)同mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA (b)同mRNA互補(bǔ)的雙鏈DNA (c)以mRNA為模板合成的雙鏈DNA (d)以上都正確36．用堿法分離質(zhì)粒DNA時，染色體DNA之所以可以被除去，是因為：( ) (a)染色體DNA斷成了碎片 (b)染色體DNA分子量大，而不能釋放 (c)染色體變性后來不及復(fù)性 (d)染色體未同蛋白質(zhì)分開而沉淀37. 關(guān)于堿解法分離質(zhì)粒DNA，下面哪一種說法不正確?( ) (a)溶液I的作用是懸浮菌體 (b)溶液Ⅱ的作用是使DNA變性 (c)溶液Ⅲ的作用是使DNA復(fù)性 (d)質(zhì)粒DNA分子小，所以沒有變性，染色體變性后不能復(fù)性38. Clark做了一個有趣的實驗，發(fā)現(xiàn)TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在雙鏈DNA的 末端加一個堿基，主要是加( ) ． (a)dGTP (b)dATP (c)dCTP (d)dTTP39．根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為基因組文庫、cDNA文庫等。53．Northern印跡和Southern印跡有兩點根本的區(qū)別： (1)印跡的對象不同：Northern是RNA，Southern是DNA；(2)電泳條件不同，前者是變性條件，后者是非變性條件。47．根據(jù)Northern雜交的結(jié)果可以說明：外源基因是否進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄_。42．目前，在重組體的篩選中，已經(jīng)發(fā)展了許多構(gòu)思巧妙、具有極高準(zhǔn)確性的篩選方法。35． 假定克隆一個編碼某種蛋白質(zhì)的基因，必須考慮其表達(dá)的三個基本條件： (1)保持正確的可讀框 (2)能夠使其轉(zhuǎn)錄的啟動子 (3)具有翻譯的起始和終止信號36． 受體細(xì)胞的感受態(tài)是接受外源DNA的生理狀態(tài)_。25． 黏粒(cosmid)是質(zhì)?！删w雜合載體，它的復(fù)制子來自質(zhì)粒、COS位點序列來自 l噬菌體，最大的克隆片段達(dá)到45 kb。19． pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，它的復(fù)制子來源于pMBl ，它的四環(huán)素抗性基 因來自于pSCl01，它的氨芐青霉素抗性基因來自于pSF2124(R質(zhì)粒)。一339。12．測序酶是修飾了的T7 DNA聚合酶，它只有_ 539。8．限制性內(nèi)切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的來源不同，但識別的序列都是GGCC，它們屬于異源同工酶。5． 限制性內(nèi)切核酸酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的，第一個大寫字母取自屬名的第一個字母，第二、三兩個字母取自_種名的前兩個字母，第四個字母則用株名表示。外切核酸酶的活性。13．切口移位(nick translation)法標(biāo)記DNA的基本原理在于利用DNA聚合酶I的__539。17．就克隆一個基因(DNA片段)來說，最簡單的質(zhì)粒載體也必需包括三個部分：__復(fù)制區(qū)： 含有復(fù)制起點；選擇標(biāo)記： 主要是抗性基因；克隆位點： 便于外源DNA的插入。它的復(fù)制子來自 pMBl ，Amp 抗性基因則是來自 轉(zhuǎn)座子。31． 引物在基因工程中至少有4個方面的用途：(1)合成探針；(2)合成cDNA；(3)用于PCR反應(yīng)；(4)進(jìn)行序列分析32．Clark發(fā)現(xiàn)用Taq DNA聚合酶得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物不是平末端，而是有一個突出 堿基末端的雙鏈DNA分子。41．人工感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞在溫度為0176。45．如果用限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生5’突出的黏性末端，則可以用_ Klenow酶填補(bǔ)的方法_進(jìn)行3’末端標(biāo)記。3’合成酶_和_3’ 174。 (a)5，3，合成酶， (b)3，5，外切酶 (c)5，3，外切酶 (d)轉(zhuǎn)移酶22． 下面關(guān)于松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)性質(zhì)的描述中，( )是不正確的 (a)質(zhì)粒的復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，而不受染色體復(fù)制機(jī)制的制約， 因而有較多的拷貝數(shù) (b)可以在氯霉素作用下進(jìn)行擴(kuò)增 (c)通常帶有抗藥性標(biāo)記 (d)同嚴(yán)緊型質(zhì)粒融合后，雜合質(zhì)粒優(yōu)先使用松弛型質(zhì)粒的復(fù)制子 23． 基因工程中所用的質(zhì)粒載體大多是改造過的，真正的天然質(zhì)粒載體很少，在下列載 體中只有( )被視為用作基因工程載體的天然質(zhì)粒載體 (a)pBR322 (b)pSCl01 (c)pUBll0 (d)pUCl8 24． 下列哪種克隆載體對外源DNA的容載量最大?( ) (a)質(zhì)粒 (b)黏粒 (c)酵母人工染色體(YAC) (d) l噬菌體 (e) cDNA表達(dá)載體 25. 松弛型質(zhì)粒： ( ) (a)在寄主細(xì)胞中拷貝數(shù)較多 (b)可用氯霉素擴(kuò)增 (c)一般沒有選擇標(biāo)記 (d)上述(a)、(b)兩項正確 26．Col El是惟一用作基因工程載體的自然質(zhì)粒，這種質(zhì)粒： ( ) (a)是松弛復(fù)制型 （b)具有，四環(huán)素抗性 (c)能被氯霉素擴(kuò)增 (d)能產(chǎn)生腸桿菌素27．同一種質(zhì)粒DNA，以三種不同的形式存在，電泳時，它們的遷移速率是：( ) (a)OCDNASCDNALDNA (b)SCDNALDNAOCDNA (c)LDNAOCDNASCDNA (d)SCDNAOCDNALDNA28．pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，含有兩個抗性基因，其中四環(huán)素抗性基因來自： ( ) (a)ColEl (b)Ri質(zhì)粒 (c)pSCl01 (d)pUCl829．關(guān)于穿梭質(zhì)粒載體，下面哪一種說法最正確?( ) (a)在不同的宿主中具有不同的復(fù)制機(jī)制 (b)在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制起點 (c)在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制酶 (d)在不同的宿主細(xì)胞中具有不同的復(fù)制速率30．能夠用來克隆32kb以下大小的外源片段的質(zhì)粒載體是( ) (a)charomid (b)plasmid (C)cosmid (d)phagemid31．第一個作為重組DNA載體的質(zhì)粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl832. Ti質(zhì)粒：( ) (a)可從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)到植物細(xì)胞中 (b)作為雙鏈DNA被轉(zhuǎn)移 (c)在植物中導(dǎo)致腫瘤 (d)介導(dǎo)冠癭堿的合成，作為細(xì)菌的營養(yǎng)物和植物的生長激素 (e)需要細(xì)菌的vir基因幫助轉(zhuǎn)移 (f)在植物細(xì)胞中作為染色體外質(zhì)粒33．黏粒(cosmid)是一種人工建造的載體，( ) (a)它具有COS位點，因而可進(jìn)行體外包裝 (b)它具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制特性 (c)進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起裂解反應(yīng) (d)進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起溶源化反應(yīng)34．有兩種確定核酸中核苷酸序列的方法：化學(xué)序列分析法(MaxamGlbert)和酶學(xué)序列分析法(Sanger)。 (a)既能標(biāo)記DNA，又能標(biāo)記RNA (b)既能標(biāo)記雙鏈DNA又能標(biāo)記單鏈DNA (c)只能標(biāo)記突出的539。端向339。CGAACATATGGAGT339。7． 什么是測序酶(sequenaseTM)?所謂測序酶即是修飾了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，從外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中除去28個氨基酸，這樣使T7 DNA聚合酶完全失去了339。10． 列舉質(zhì)粒載體必須具備的4個基本特性。 (1)COS位點可以自身環(huán)化； (2)可以利用COS位點包裝l噬菌體顆粒； (3)可以感染寄主細(xì)胞； (4)利用質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制，不整合、不裂解。在引物的5’端加上合適Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，以便于后來的克隆。23．切口移位(nick translation)標(biāo)記探針的主要步驟有哪些? (1)DNaseI造成切口； (2)DNA聚合酶III的5’ 174。用該酶切割后，用 DNA聚合酶將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán)，轉(zhuǎn)化Lac Tets受體菌，篩選Tetr轉(zhuǎn)化子，問：Lac的基因型是什么?并說明原因。27． 放射性抗體檢測法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?28． 什么是隨機(jī)引物(random primer)?如何標(biāo)記DNA?29．什么是印跡(blotting)雜交?30．什么是原位菌落雜交(colony hybridization)?31．說明Southern雜交的原理和方法。3． 答： 影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有很多，但溫度對連接反應(yīng)的影響較大。 另外反應(yīng)體系中有NH4+離子的存在，對E．coli DNA連接酶具有激活作用。外切核酸酶活性。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸，用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備339。突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。)作用與聚合(539。5．答： 主要差別是：CIP68176。單核苷酸，作用底物是雙鏈DNA的539。7．答： DNase I是一種內(nèi)切核酸酶，在Mg2+存在下，DNase I隨機(jī)切割DNA兩條鏈中的任意一條鏈；當(dāng)Mn2+代替Mg2+時，DNase I幾乎是在雙鏈DNA兩條鏈相對的位置上打開缺口，使雙鏈DNA斷裂，產(chǎn)生的末端幾乎是平末端或只突出1～2個核苷酸的DNA片段。 所謂par功能是指某些質(zhì)粒，包括F、R1等質(zhì)粒上具有的一些短的區(qū)域，這些區(qū)域能夠增強(qiáng)質(zhì)粒拷貝的合適分配。當(dāng)細(xì)胞生長時，位點也加倍，每一個質(zhì)?？截惤Y(jié)合一個位點。 模型B同模型A基本類似，在這個模型中，質(zhì)粒的兩個拷貝在同質(zhì)膜結(jié)合之前必須通過它們的par位點相互配對。這些質(zhì)粒編碼一些毒性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)一旦表達(dá)就會殺死細(xì)胞。這些系統(tǒng)使細(xì)胞對質(zhì)粒產(chǎn)生溺愛，并防止細(xì)胞丟失質(zhì)