【正文】 子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下漣接成為重組的DNA。由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時(shí)間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時(shí)間性．有些則需要特殊的環(huán)境條件。19．答： 同mRNA互補(bǔ)的DNA稱為cDNA。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體，包括下列過(guò)程：(1)高分子量染色體DNA的制備；(2)體外重組連接；(3)包裝蛋白的制備；(4)重組體的體外包裝；(5)將重組DNA導(dǎo)人寄主細(xì)胞；(6)篩選?；蛘呃孟鄳?yīng)的抗體從cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選相應(yīng)的克隆。 15．答： 雖然噬菌粒載體攜帶有M13的IG區(qū)，能夠合成單鏈DNA，但是它沒(méi)有M13的功能基因，沒(méi)有M13基因2的產(chǎn)物存在，所以不能合成單鏈DNA。 黏粒載體也有如下不足：(1)如果兩個(gè)黏粒之間有同源序列，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果會(huì)使被克隆的片段重排或丟失。 (4)容載能力大。 (2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。13．答 M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)： (1)克隆的片段大：M13噬菌體的DNA在包裝時(shí)不受體積的限制，所以容載能力大，有報(bào)道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA長(zhǎng)6—7倍的DNA(插人片段可達(dá)40kb)。如果插入的外源DNA引起a肽的可讀框的改變，或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就會(huì)形成白色噬菌斑。11．答： 這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來(lái)篩選重組體。10． 答： (1)菌體DNA沒(méi)有容載能力，因?yàn)槭删w的頭部對(duì)DNA包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105％，所以要將l噬菌體改造成載體，必須削減分子量。對(duì)于多數(shù)基因克隆操作來(lái)說(shuō)，都不希望載體能夠進(jìn)行自主傳遞，也不希望被帶動(dòng)轉(zhuǎn)移。如果一個(gè)細(xì)胞丟失了質(zhì)粒，既沒(méi)有毒性蛋白也沒(méi)有解毒劑的合成。 例如，質(zhì)粒的毒性蛋白Ccd,通過(guò)改變DNA螺旋酶來(lái)殺死細(xì)胞，由于螺旋酶的改編，引起了雙螺旋DNA的斷裂。在一類復(fù)仇的細(xì)胞中，質(zhì)粒能夠編碼一些殺死丟失了質(zhì)粒的細(xì)胞。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒常常具有增加質(zhì)粒適當(dāng)分離的位點(diǎn)，但是這些區(qū)域并沒(méi)有相同的結(jié)構(gòu)，并不以相同的機(jī)制起作用。染色體上有很多的位點(diǎn)，并且隨著DNA的復(fù)制而加倍，這些位點(diǎn)可供質(zhì)粒結(jié)合。這就保證了質(zhì)粒不會(huì)丟失。 模型．A：par位點(diǎn)同細(xì)菌質(zhì)膜的一個(gè)假定位點(diǎn)結(jié)合。已經(jīng)深入研究過(guò)P1質(zhì)粒的分離系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)P1質(zhì)粒的分離系統(tǒng)由一個(gè)順式激活par序列和兩個(gè)蛋白ParA和，ParB的基因構(gòu)成，其中一個(gè)蛋白同par位點(diǎn)結(jié)合。為了避免這種情況的發(fā)生，很多質(zhì)粒都具有位點(diǎn)專一性重組的系統(tǒng)，可以破壞多聚體。8．答： 質(zhì)粒通過(guò)以下幾種機(jī)制維持在細(xì)胞中的穩(wěn)定： (1)多聚體質(zhì)粒的分解 如果質(zhì)粒在復(fù)制時(shí)形成多聚體的話，在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)粒丟失的可能性就會(huì)增加。在基因工程中主要用于除去雙鏈DNA突出的539。端。 (2)DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。C穩(wěn)定，且耐酚抽提。外切核酸酶活性較強(qiáng)。)作用達(dá)到平衡。隱含末端，然后在高濃度的標(biāo)記底物( 32pdNTP)存在下，使降解(339。突出末端(protruding end) 該反應(yīng)分兩步進(jìn)行：先用339。外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng)。 用Klenow酶修復(fù)539?；?39。引物的539。外切核酸酶的活性，小片段具有539。4． 答： Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到兩個(gè)片段，其中大片段的分子量為75kDa，它具有539。平末端連接時(shí)連接酶的濃度要比黏性末端連接時(shí)高10100倍。C一15176。條件的改變，限制酶的特異性就會(huì)松 動(dòng)，識(shí)別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱第二活性，而將這種因 條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示，因此第二活性又稱為星 活性。 基本原則： 34個(gè)字母組成，方式是：屬名+種名+株名+序號(hào)； 首字母： 取屬名的第一個(gè)字母，且斜體大寫(xiě)；第二字母： 取種名的第一個(gè)字母，斜體小寫(xiě)； 第三字母： (1)取種名的第二個(gè)字母，斜體小寫(xiě)； (2)若種名有詞頭，且已命名過(guò)限制酶，則取詞頭后的第一字母代替。21．什么是同聚物加尾連接法(homopolymer tails joining)?用何種方法加尾?具有哪些優(yōu) 缺點(diǎn)?22．何謂接頭連接法(1inker ligation)?23．什么是同裂酶?為什么說(shuō)用同裂酶進(jìn)行體外重組效率最高?24．為了大量獲得許多用于生化鑒定的產(chǎn)物，你想將擬南芥中的一個(gè)序列已知、編碼單 體酶蛋白的基因在單細(xì)胞微生物中表達(dá)，你如何確保最終能得到產(chǎn)物?25．某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgl I的切點(diǎn)。27．在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子? 這是因?yàn)榧?xì)菌沒(méi)有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子之故。它與Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在Western印跡中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì))。3’合成酶進(jìn)行修補(bǔ)； (4)在修補(bǔ)過(guò)程中，隨著切口(nick)的移動(dòng)，將放射性的底物摻人到雙鏈DNA中。然后用標(biāo)記探針雜交，最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影片是空白。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴(kuò)增片段，可以直接測(cè)序或克隆到合適的載體再測(cè)序。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì) 一個(gè)方案用PCR從染色體DNA擴(kuò)增突變的ThyA基因，測(cè)定突變的序列。18． 何謂YAC? 主要特性是什么? (1)含有來(lái)自其他生物DNA的酵母人工染色體，叫YAC； (2)主要特性是可以克隆較大的外源片段。15． 怎樣將一個(gè)平末端DNA片段插入到EcoR I限制位點(diǎn)中去?化學(xué)合成一些長(zhǎng)為10bp含有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來(lái)，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會(huì)產(chǎn)生EcoRI的單鏈末端。11． 什么叫穿梭載體？ 含有細(xì)菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNA片段的雜種質(zhì)粒，有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和既能在細(xì)菌又能在真核細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個(gè)宿主(來(lái)回穿梭)。YAC能夠容納長(zhǎng)達(dá)幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。的外切核酸酶活性，只有539。539。CATATG3，4．下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)(哪些)最有可能是Ⅱ類酶的識(shí)別序列：GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 為什么?GATATC；AAATTT，因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄小?．某學(xué)生在用EcoRI切割外源DNA片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性，請(qǐng)分析可能的原因?鹽離子濃度不對(duì)，溫度不對(duì)，甘油濃度過(guò)高。羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的339。末端標(biāo)記，可用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)T4DNA聚合酶 (d)T7DNA聚合酶答案1．c；2．c； 3．b； 4．b 5．b，C，d，e； 6．c； 7．b； 8．d；9．d； 10．B； 11．d； 12．a(chǎn)； 13．d； 14．b 15．d； 16．c；17．a(chǎn)，b；18．a(chǎn)；19．c；20．d；21．c；22．C； 23．b； 24．C；25．d；26．a(chǎn)，C，d；27．b；28．c； 29．b；30．a(chǎn)；31．c； 32．a(chǎn),c,d,e， 33．a(chǎn)，b，c；34．b； 35．c；36．c； 37．d； 38．b；39．c；40．a(chǎn)；41．c； 42．a(chǎn)，b，c； 43．b； 44．b； 45．d； 46．a(chǎn)；47．a(chǎn)； 48．c； 49．c；50．b；51．c； 52．c； 53．b； 54．a(chǎn),c,d；55．a(chǎn)； 56．b；57．a(chǎn)，b； 58．c；59．a(chǎn)；60．d；61．b； 62．c；三、簡(jiǎn)答題1．說(shuō)明Sanger DNA測(cè)序法的原理。OH的存在51．Southem印跡的DNA探針( )雜交。外切核酸酶切除42．在DNA的酶切反應(yīng)系統(tǒng)中，通常：( ) (a)用SSC緩沖液 (b)加入Mg2+作輔助因子 (c)加入BSA等保護(hù)劑 (d)上述說(shuō)法中，有兩項(xiàng)是正確的43． 黏性末端連接法，不僅操作方便，而且( ) (a)產(chǎn)生新切點(diǎn) (b)易于回收外源片段 (c)載體不易環(huán)化 (d)影響外源基因的表達(dá)44．在下列表型中，( )是基因工程上理想的受體菌表型 (a)r+m+rec* (b)rmrec (C)rmrec+ (d)r+m+rec45．關(guān)于DNA接頭在基因工程中的作用，下列說(shuō)法中哪一項(xiàng)不正確?( ) (a)給外源DNA添加適當(dāng)?shù)那悬c(diǎn) (b)人工構(gòu)建載體 (c)調(diào)整外源基因的可讀框 (d)增加調(diào)控元件46．cDNA文庫(kù)包括該種生物的( ) (a)某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 (b)所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 (c)所有結(jié)構(gòu)基因 (d)內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)47．下列關(guān)于建立cDNA文庫(kù)的敘述中，哪一項(xiàng)是錯(cuò)誤的?( ) (a)從特定組織或細(xì)胞中提取DNA或RNA (b)用反轉(zhuǎn)錄酶合成mRNA的對(duì)應(yīng)單鏈DNA (c)以新合成的單鏈DNA為模板合成雙鏈DNA (d)新合成的雙鏈DNA甲基化 48．下列對(duì)黏性末端連接法的評(píng)價(jià)中，哪一項(xiàng)是不正確的? ( ) (a)操作方便 (b)易于回收片段 (c)易于定向重組 (d)載體易于自身環(huán)化，降低重組率49．關(guān)于感受態(tài)細(xì)胞性質(zhì)的描述，下面哪一種說(shuō)法不正確?( ) (功具有可誘導(dǎo)性 (b)具有可轉(zhuǎn)移性 (c)細(xì)菌生長(zhǎng)的任何時(shí)期都可以出現(xiàn) (d)不同細(xì)菌出現(xiàn)感受態(tài)的比例是不同的50．下面關(guān)于用T4多核苷酸激酶標(biāo)記539。這樣既減少純化步驟，也節(jié)約了開(kāi)支。 (a)Sau3A I (b)E．coRI (c)hind III (d)Sau 3A112．限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性是指：( )(a)在非常規(guī)條件下，識(shí)別和切割序列發(fā)生變化的活性。52．根據(jù)外源片段提供的遺傳表型篩選重組體，必需考慮三種因素：(1)克隆的是完整的基因；(2)使用的是表達(dá)載體；(3)不含內(nèi)含子。50．在__ Southern印跡_技術(shù)中，DNA限制性片段經(jīng)凝膠電泳分離后，被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(或尼龍膜)上，然后與放射性的DNA探針雜交。46．單鏈DNA探針的標(biāo)記可以采用下列方法：(1)用M13噬菌體載體合成單鏈DNA探針；(2)從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA探針；(3)用不對(duì)稱PCR合成單鏈DNA探針。44． 核酸雜交探針可分為兩大類： DNA探針和RNA探針。C _時(shí)攝人DNA。39．將含有一個(gè)mRNA的DNA拷貝的克隆稱作一個(gè)_cDNA克隆，源于同一批RNA制備物的克隆群則構(gòu)建了一個(gè)_ cDNA文庫(kù)_。33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 第二鏈合成時(shí)形成的發(fā)夾環(huán) 34．乙醇沉淀DNA的原理是乙醇使DNA分子脫水。29． 在分離DNA時(shí)要使用金屬離子螯合劑，如EDTA和檸檬酸鈉等，其目的是 螯合Mg2+離子，抑制核酸酶的活性 。24． 野生型的M13不適合用作基因工程載體，主要原因是沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)和 選擇標(biāo)記。22．pUCl8質(zhì)粒是目前使用較為廣泛的載體。 18． 一個(gè)帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在有EB的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后，一部分細(xì)胞中已測(cè) 不出質(zhì)粒，這種現(xiàn)象叫 質(zhì)粒消除(或治愈) 。15．反轉(zhuǎn)錄酶除了催化DNA的合成外，還具有__核酸水解酶H的作用，可以將DNA RNA雜種雙鏈中的_RNA_水解掉。外切核酸酶和539。539。11．EGTA是_Ca2+_離子螯合劑。合成酶的活性； (2) 339。7．第一個(gè)分離的限制性內(nèi)切核酸酶是EcoK；而第一個(gè)用于構(gòu)建重組體的限制性內(nèi)切核酸酶是_ EcoRl。. . . . .現(xiàn)代分子生物學(xué)習(xí)題及答案一、填空題1． 基因工程是70年代發(fā)展起來(lái)的遺傳學(xué)的一個(gè)分支學(xué)科。6．部分酶切可采取的措施有：(1)減少酶量；(2)縮短反應(yīng)時(shí)間；(3)增大反應(yīng)體積等。339。10．為了防止DNA的自身環(huán)化，可用堿性磷酸酶去雙鏈DNA_5’端的磷酸基團(tuán)。合成酶的活性，而沒(méi)有339。一339。14．欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)變成平末端的雙鏈形式，通?？刹捎胈___ S1核酸酶切割或DNA聚合酶補(bǔ)平。另外，一個(gè)理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子量。21．pSCl01是一種 嚴(yán)緊 復(fù)制的質(zhì)粒。23．噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：一是它在細(xì)菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNA的擴(kuò)增； 二是對(duì)某些噬菌體(如l噬菌)的遺傳結(jié)構(gòu)和功能研究得比較清楚，其大腸桿菌宿主系統(tǒng)的遺傳也研究得比較詳盡。28．l噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DNA片段后，總的長(zhǎng)度應(yīng)在噬菌體基 因組的 75％～105％ 的范圍內(nèi)。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)了克隆PCR產(chǎn)物的T—載體。38． 將含有外源基因組一個(gè)酶切片段的質(zhì)粒稱之為含有一個(gè)基因組DNA克隆_，各種此類質(zhì)粒的集合體稱之為構(gòu)建了一個(gè)基因組DNA文庫(kù)。C 時(shí)吸附DNA, 42176。43．PCR擴(kuò)增篩選重組體是比較簡(jiǎn)便的篩選方法，它適合于_插入外源片段的種類較多，大小又極為相似的重組體的篩選。如果用限制性內(nèi)切核