【正文】 aq DNA聚合 酶催化的聚合反應(yīng)的普遍 則 Taq DNA酶還常常導(dǎo)致擴增產(chǎn)物的缺失突變。然而通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使 Taq酶的 聚合出錯率降低到原來的 1/3。 PCR引物的設(shè)計原則 退火溫度（ Ta） 引物的退火溫度一般要比估計的相應(yīng)熔點溫度低 5℃ 左右，在很多 情況下，兩條引物的退火溫度不盡相同，只要兩者相差不到 46℃ ， 尚 不至于影響 RCR擴增反應(yīng)的產(chǎn)量，但它們的退火溫度應(yīng)在 5575℃ 范圍 引物堿基 ≤20， Ta = 4 X（ G+C） + 2 X（ A+T） 5（ ℃ ） 內(nèi)。在模 板量一定的情況下，降低引物濃度實際上也是降低引物與模板 的分子之比。 延伸聚合溫度和時間 延伸聚合溫度和時間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 72 ℃ 60 120 secs PCR擴增反應(yīng)中普遍使用的 DNA聚合酶的聚合速度每秒至少 50 個堿基，所以如果 PCR擴增產(chǎn)物長度小于 400 bp， 聚合時間可以少 于 15秒，特別是當(dāng)退火溫度選得較高的時候，在退火階段就有一些 單體摻入。 貝的特定 DNA序列。 PCR臨床診斷術(shù) PCR臨床疾病診斷術(shù)的主要原理有下列幾個方面： 檢測病變基因的缺失或缺損 （擴增產(chǎn)物變小或無擴增產(chǎn)物） 檢測病變基因的點突變 （擴增產(chǎn)物電泳遷移率改變） 檢測病變基因的重排 （擴增產(chǎn)物大小改變） 上述方法可以診斷包括各類遺傳病、惡性腫瘤、免疫紊亂在內(nèi)的多 種疾病，但始終沒有獲得美國 FDA的批準(zhǔn)，其主要原因是 PCR診斷術(shù)的 檢測染色體易位 （擴增產(chǎn)物大小改變） 骨髓移植的 PCR指紋圖譜快速配型 （隨機引物擴增） 檢測病變 mRNA的結(jié)構(gòu) （ 擴增產(chǎn)物大小改變） 可靠性還受到置疑，有時使用不同的程序會產(chǎn)生兩種截然不同的結(jié)果。 不對稱 PCR（ Asymmetric PCR） 在 PCR擴增循環(huán)中引入不同 的引物濃度，使得由兩條引物介 導(dǎo)擴增反應(yīng)呈不對稱狀態(tài)，這種 戰(zhàn)略稱為 不對稱 PCR技術(shù)。 變性溫度和時間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 92 96℃ 30 120 secs 退火雜交溫度和時間 退火溫度和時間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 37 65℃ 10 120 secs 退火時，引物迅速雜交。 引物的在線設(shè)計工具及免費軟件簡介 Primers! /javascript/ Primers!是一種基于 Java的引物設(shè)計程序，可以選擇所期望的引物 長度、最大 Tm值、最小 Tm值、誤配堿基對數(shù)等四種參數(shù)輸入引物序列 其特殊的優(yōu)點是能限定所輸入的序列中適合引物設(shè)計的區(qū)域，這對檢索 若干 kb長的 DNA片段中各種可能的引物是很有利的。 PCR模板制備與純化 從各種粗樣品中去除 PCR反應(yīng)抑制劑的程序不盡相同，但常用的 手段包括： 樣品稀釋 溶劑萃?。?氯仿 ﹕ 異戊基乙醇 49﹕1 ） 乙醇沉淀 高速離心 超濾 粗樣品中的 PCR抑制劑 糞便 膽鹽、膽紅素（抑制濃度 50mg / mL） 血液 亞鐵血紅素、聚乙醇磺酸鈉、 heparin（ 抗凝劑） 土壤 腐殖物質(zhì)、含鐵化合物 植物 硫酸右旋糖苷 食品 未鑒定的抑制劑 痰液 未鑒定的抑制劑 PCR模板的使用 PCR模板 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 102 105 拷貝 特異性的改進(jìn)： 增加模板 DNA的量、降低引物與模板的分子比 有效性的改進(jìn)： 增加引物與模板的分子比 模板濃度的變化很大程度上取決于待擴增的堿基序列，但一般 而言，模板 DNA長度小， PCR擴增產(chǎn)物的量就大，因此對于大分子 量的模板 DNA（ 尤其是真核生物基因組 DNA）， 在擴增之前最好先 用超聲波處理或限制性酶消化 。 PCR擴增反應(yīng)的精確性 2 PCR的 DNA聚合酶與擴增的精確性 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的使用 PCR擴增反應(yīng)的精確性 利用 PCR技術(shù)擴增 DNA靶序列的一個重要問題是這種 DNA體外聚 合反應(yīng)的序列忠實程度，即 DNA擴增產(chǎn)物序列的 準(zhǔn)確率 。 X 10–7 X 10–6 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Vent DNA聚合酶具有 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性和校正功能，因此 與其它 DNA聚合酶（如 Taq酶 ）相比，具有相對較好的高保真性，其 出錯率為 X 10–5 X 10–5 ； Vent DNA聚合酶（ Thermococcus litoralis） 度小于 2 kb時，擴增產(chǎn)物的長度與 Mg2+的濃度并無關(guān)聯(lián)； 如果擴增長度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+， 而在擴增長 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。 盡可能高的互補程度是必要的。 準(zhǔn)確性的改進(jìn)： 降低 dNTPs的濃度，但要注意 Mg+2的摩爾濃度 也應(yīng)同步降低。 反應(yīng)體積 反應(yīng)體積 的標(biāo)準(zhǔn)范圍： 20 100 ml（ ml的小離心管 ） 有效性的改進(jìn)： 增加反應(yīng)體積以及保溫時間，以充分保證熱平衡； 5 ml的反應(yīng)體積也有成功的例子。 5’ 5’ 5’ dGTP 5’ 5‘ CCCCCCCC PCR 3‘ GGGGGGGG 5’ 5‘ CCCCCCCC 3’ PCR 5‘ CCCCCCCC 5’ 特異性引物 7 PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用 特定 DNA序列的克隆與重組子的鑒定 PCRSSCP檢測基因序列