【正文】 制性內切酶切取目的基因 用來分離真核基因的方法。 真核表達系統(tǒng)： 酵母 、 昆蟲細胞、哺乳類細胞、轉 基因動物、轉基因植物等 。 工作代工程菌種用于生產。在 Apr基因中有一個 PstⅠ 切點， Tcr基因中有一個 BamHⅠ 和一個SalⅠ 切點。通過這種方法生產的新型生物制品稱為 基因工程生物制品 。 ?白蛋白為單鏈分子，由 584個氨基酸殘基組成， N端為天門冬氨酸， C端為亮氨酸，分子量為 104，在離子強度為 ，pI為 ，易溶于水，在 60%硫酸銨飽和度以上沉淀。 ② 堿水解法 易產生消旋作用，較少應用 。 粘多糖的聚陰離子能與某些陽離子表面活性劑結合成不溶于水的鹽 ， 如十六烷基三甲基銨 （ CTA） 等 。用上樣Buffer沖洗柱體，雜質被沖洗下來。 ?③ 然后改變流動相成份，將結合的親和物洗脫下來。凝膠顆粒具有多孔性網狀結構，小分子易進入凝膠網孔，流程長而移動速度慢，而大分子物質不能進入凝膠網孔，沿凝膠顆粒間隙流動，流程短移動快。 ② 壓力法 ， 有加壓 、 減壓 、 滲透壓三種 ③ 反復凍融法 ， 設備簡便 ， 活性保持好 ， 但用時較長 。 第二章 生物制品的制備 （ Preparation） 第一節(jié) 一般生物制品的制備方法 (Preparation of general biopreparate ) 一、生物制品原料的選擇、預處理與保存方法 （ Selection、 pretreatment and preservation of raw material of biopreparate） （ 1）原料選擇 原料的選擇原則 ： ①有效成分含量高，新鮮； ②原料來源豐富，產地較近； ③原料中雜質含量少； ④原料成本低等。 ④ 超聲波振蕩破碎法 ， 該方法破碎效果較好 ， 但由于局部發(fā)熱 ， 對活性有損失 。這種現象稱為分子篩效應。（見 Fig Fig2） 。形成雜質峰（見下圖）。 ? 離子交換層析法 （ ion exchange chromatagraphy)：粘多糖的聚陰離子能夠很好地被陰離子交換劑吸附和分離，如Dowex IX2（商品名）離子交換樹脂、DEAE離子交換纖維素（二乙胺乙基）等。 ③ 酶水解法 水解不夠完全。對酸較穩(wěn)定，受熱變性。 上游技術：工程菌的構建 下游技術：目的基因產物的分離純化 一、上游技術：工程菌的構建 目的基因的分離制備與鑒定 重組載體的選擇與制備 目的基因與載體的重組 構建的重組載體轉染適當的受體細胞（表達載體） 篩選含有重組子的細胞進行擴增 目的基因的分離制備與鑒定 （ 1）目的基因所處染色體的確定 （ 2）目的基因的獲取 目的基因可以是染色體 DNA、 cDNA或人工合成的 DNA，目的基因不同，獲取方法也不同。 pBR322 Apr PstⅠ BamHⅠ SalⅠ 用限制性內切酶和連接酶將所需目的基因插入選定的載體中。 。 目的基因與載體的重組 原核表達系統(tǒng)： 大腸桿菌 、 枯草芽孢桿菌、鏈霉菌 。獲取的基因是染色體 DNA。 血（無抗凝劑） → 自然凝固 → 分離出血清（無纖維蛋白酶原、凝血因子等） 血 +混合抗凝劑 草酸銨 草酸鉀 離 心 上清血漿 總蛋白： % 白蛋白： % 水： 9092% （現常用肝素、檸檬酸鈉） （ 2）工藝路線 利凡諾 ,NaHCO3 ,離心分離 絡合物 蒸餾水， NaCl， HCl 弱酸性， 40℃ ，離心 離心液 濃 縮 超 濾 濃縮液 滅活病毒 65℃ ， 1h； 60℃ ， 10h 熱處理液 除菌 除菌過濾 白蛋白液 干燥 冷凍干燥 白蛋白 去雜蛋白 人血漿（ %） 男性尿 沉淀 10℃ 下， 上清尿液 酸 化 酸化尿 吸 附 硅藻土， 5℃ 硅藻土吸附物 洗滌 5℃ ，水 硅藻土柱 洗脫 %氨水， 洗脫液 去熱源、色素 DEAESephadexA50柱， , （二乙氨乙基葡聚糖） 流出液 （活性部分 ） 濃 縮 羧甲基纖維素（ CMC柱， ) CMC柱 洗脫（ HACNaAC) NH3+NaCl, 洗脫液 透 析 H2O,4℃ 透析液 凍 干 成品 二、尿激酶（ urokinase）的制備 一噸可制成 90克粗品，治療各種新血栓形成或血栓梗塞疾病。 ?化學合成與酶促合成法 化學合成法 一般得到的是 DL— 型氨基酸 ， 尚需要對異構體拆分； 酶促合成法 也是酶工程在醫(yī)藥工業(yè)上的應用 ， 優(yōu)點是技術工藝簡單， 轉化率高 ， 副產物少和易提純等 。 六 、 脂類制品的分離純化方法 （ isolation and depuration of lipoid） （ 1） 提取方法 （ extraction ） 脂類自然狀態(tài)下是以結合形式存在的 。 四、核酸類制品的分離純化方法 （ Isolation and