【正文】 3[(4硝基苯氧基 )甲基 ]吲哚 4,7二酮（ 1）； 5甲氧基 1甲基 3【 (2,4,6三氟苯氧基）甲基】吲哚 4,7二酮（ 2）；】被合成 2） 重組人 NRH:醌氧化還原酶 2（ NQO2）自 SigmaAldrich（圣路易斯，密蘇里州）得到。 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測 1） 細(xì)胞（ 4 10^5）分別接種到 60毫米的培養(yǎng)皿。 3） 然后，不同濃度的 IQs分別為加入（該混合物的終體積為 150微升）， 30min內(nèi)，每5分鐘取 20 微升樣品，測量 TR1活性，采用 DTNB還原法，如先前所描述的（ Fang等人，2022）。 肽碎片譜的自動分析（ MS / MS）基于 MASCO進(jìn)行（矩陣科學(xué)，倫敦，英國）的計算機(jī)算法進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索和蛋白質(zhì)鑒定。 勻漿物在 4℃下， 14000g離心力下離心 15分鐘。脫鹽蛋白（ 50微克）由 15％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。 IQs對人胰腺癌的生長抑制活性 在 MIA PACA2胰腺癌細(xì)胞系 用 MTT法對 IQs 1和 2對人胰腺癌細(xì)胞生長的影響的評估。純化的 TR1由 IQs孵化，消化， 并進(jìn)行MS / MS分析。這兩種酶的活性都不受到 IQ 處理不酶的活性受到 IQ 治療濃度的影響，從而成為了，有效的抑制 TR1（圖 4， A和 B）。 智商處理對 MAPK信號通路的影響 在胰腺癌細(xì)胞。該 thioredoxin 在 MIA中 PACA2細(xì)胞 1的氧化還原狀態(tài)后進(jìn)行了評估 1小時 IQ治療。圖 4E表 明， IQs 在細(xì)胞中對于TR1的抑制明顯高于金諾芬（高達(dá) 11 倍的效力）。 當(dāng) NADPH還原的 TR1被 NQO2/ NRH還原的 IQ1或 2孵育后，觀測到 TR1的活性的劑量依賴性抑制的 （圖 3A）。 結(jié)果 用于這項(xiàng) 研究的 IQs 一系列的 IQs用我們以前的研究被篩選，可作為對潛在的抗胰腺癌藥物（ Yan等， 2022）。簡言之，將細(xì)胞收集到新鮮制備的裂解緩沖液（ 50mM的 TrisHCl， pH 值 ， 2mM EDTA的加入6M胍鹽酸鹽， ％的 Triton X100，和 50mM碘乙酸），然后在黑暗中于 37℃下進(jìn)行 30分鐘。該法混合物（ 1ml）中含有 50mM磷酸鉀， 1 Mm EDTA， 1單位 / ml GR， 1mM GSH和 200微 m的 NADPH， 平衡 5分鐘 。分析純化的胰蛋白酶。蛋白質(zhì)含量采用 Lowry等人的方法進(jìn)行測定。 3）然后用含有 IQs的完全培養(yǎng)基（ 200微升 /孔）處理 72小時或治療為 4小時無藥物的培養(yǎng)基孵化后，接著培養(yǎng)在藥物培養(yǎng)基， 37℃額外 72小時。Saitoh et al., 1998). 我們之前的研究表明靶位點(diǎn) TR1可能是引起 IQ 毒性的潛在機(jī)制。這些化合物共有吲哚酚類的骨架結(jié)構(gòu)，但是在醌環(huán)和吲哚環(huán)上有不同的取代。氧化的硫氧還蛋白被認(rèn)為激活了細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶 1—— 是在 MAPK信號級聯(lián)中的 p38/JNK上游活化酶，這些已經(jīng)在研究中被證實(shí)，從而提供了 Q誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。 Matthews et al., 1992。細(xì)胞保持在濕潤的培養(yǎng)箱中含有 5％二氧化碳， 37℃。 5分鐘后，在冰上溫育后，將樣品 以 1000g離心 5分鐘。 7） 消化產(chǎn)品使用 SpeedVac中（默飛世爾科技，沃爾瑟姆干燥， MA）和重新溶解在％三氟乙酸。 細(xì)胞超聲波處理后， NADPH的消耗相當(dāng)于在 340nm處吸光度的減少，在 1 mM的 GSSG的存在或不存在的情況下。樣品渦旋并溫育 5分鐘，在室溫 溫度，和吸光度 412nm處進(jìn)行測定。 統(tǒng)計分析 使用進(jìn)行統(tǒng)計分析單向方差分析后適當(dāng)?shù)氖潞髾z查： Dunt檢驗(yàn)多個觀測比較單一 控制 。 這些數(shù)據(jù)也表明活化線粒體途徑是參與細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵事件。 IQ1的 TR1抑制的 IC50值是 146nM， IQ2 的 IC50是 82nM。智商治療引起的不 增加氧氣吸收在細(xì)胞中的速率（數(shù)據(jù)未 示出）。預(yù)處理與 P38抑制劑？米），熱火顯著降低智商誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 PACA2細(xì)胞（圖 6， C和 D）。 智商處理對自由基介導(dǎo)的氧化作用 壓力， GSH / GSSG比率和非蛋白巰基的 人胰腺癌細(xì)胞。為了確定 IQs內(nèi)收的確切部位，這種肽被 MS / MS碎裂，產(chǎn)生的光譜（圖 3D）表明位點(diǎn)是硒代半胱氨酸而不是半胱氨酸殘基。在 4和 72小時處理后， IQ2的 IC 50值分別為 35和 18nM。 細(xì)胞收集在 RIPA緩沖液補(bǔ)充了蛋白酶抑制劑 cocktail（羅氏診斷，印第安納波利斯， IN）和磷酸酶抑制劑混合物（ GBiosciences公司，圣路易斯，密蘇里州）。細(xì)胞（ 2 10^6）收集到冰冷的 PBS及分成兩管。溫育 20分鐘，在 37℃后， 終止反應(yīng)，加入 200升的 1 mM的 DTNB在 6M的胍鹽酸鹽（溶解于 50mM的 TrisHCl， pH ）中。 5） 一個空白的讀數(shù)沒有添加樣品的樣本 6） 結(jié)果表示為對照的百分比（ 20微升，加入 IQs前取出樣品），并分別代表三