抗癌的吲哚酚類通過抑制硫氧還原蛋白酶和活化信號的氧化還原來誘導人胰腺癌細胞的凋亡論(文件)
【正文】 上清液中的水平用高效液相色譜 法所報告 ，然后通過 Lowry等人的方法，標準化為蛋白（ 1951）。在一個管中的細胞沉淀重懸在 RIPA 緩沖液中，用于測定蛋白質(zhì)濃度，采用 Lowry等的方法。樣品渦旋并溫育 5分鐘，在室溫 溫度，和吸光度 412nm處進行測定。細胞裂解物再紡通過脫鹽柱（微生物旋轉(zhuǎn) 。還原的和氧化的硫氧還蛋白 1的探測用兔抗人 thioredoxin 1抗體，并使用增強的化學發(fā)光檢測。細胞蛋白（ 50微克），然后用 12％ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二二氟乙烯膜。 統(tǒng)計分析 使用進行統(tǒng)計分析單向方差分析后適當?shù)氖潞髾z查： Dunt檢驗多個觀測比較單一 控制 。在當前的研究中，兩個引入化合物（圖 1A）， IQ 化合物 1和 2，被選定為研究 IQs對胰腺癌細胞的作用機理。 這兩種 IQs表現(xiàn)出明顯的生長抑制活性， IC 50值在低納摩爾范圍內(nèi)的。 IQs誘導胰腺癌細胞凋亡 之前我們已經(jīng)報道了 IQ1在 1 MIA PACA2中誘導 caspase依賴的凋亡細胞。 這些數(shù)據(jù)也表明活化線粒體途徑是參與細胞凋亡信號傳導的關鍵事件。 抑制是 NADPH依賴的（數(shù)據(jù) 未顯示），這表明酶的硒代的活性位點參與了 IQs的抑制 ；抑制也 NQO2/ NRH依賴性（數(shù)據(jù)未示出），這表明與 TR1抑制有關的毒性物質(zhì)的合成是在氧化還原和基團脫去之后。如圖 3C 中所示， 肽信號表現(xiàn)出 Se同位素分布格局特點被檢測出，分子質(zhì)量是 ，其對應于該分子 TR1的 C末端的胰蛋白酶片段加上了 IQ1衍生的亞胺中間體和一種碘代乙酰胺的修飾的分子質(zhì)量。 IQs處理 TR1的選擇性抑制人胰腺癌 癌細胞 IQs 1和 2的對細胞內(nèi) TR1的抑制能力在 MIA PACA2細胞進行測試。 IQ1的 TR1抑制的 IC50值是 146nM， IQ2 的 IC50是 82nM。 為了測試 IQs選測性的抑制 TR1， ,與兩個密切相關的酶的活性， GR和 GPX，在 IQ 處理的 Mia PaCa2 cells被測定。 IQs對 GR和 GPx的物抑制活 性表明， TR1的 C末端硒代半胱氨酸，它是 10個殘基暴露鏈中的倒數(shù)第二個 氨基酸（ Cheng等， 2022），成為了 IQs的靶點。 739。智商治療引起的不 增加氧氣吸收在細胞中的速率（數(shù)據(jù)未 示出）。如根據(jù)材料和方法所述， 還原和氧化的硫氧還蛋白 1的形式進行分離 通過后，碘天然蛋白質(zhì)凝膠電泳 酸處理的細胞的蛋白質(zhì)。智商誘導細胞凋亡 信號被審查 MIA PACA2細胞后 1小時的藥物 治療。 。預處理與 P38抑制劑？米），熱火顯著降低智商誘導的細胞凋亡 PACA2細胞（圖 6， C和 D）。 5， 無論是與智商 1或 2的智商引起劑量依賴性的治療 增加氧化的硫氧還蛋白 1伴隨著下降 在濃度低至 100納米的還原形式（ 1） 與 75納米（ 2）。 IQ 處理對 Thioredoxin的氧化還原狀態(tài)的影響 1人胰腺癌細胞。作為間接 氧化應激的指示，細胞總非蛋白 硫醇水平和 GSH / GSSG比例（參考圖 1），分別為 還確定，并且觀察到在任一指標沒有改變 經(jīng)過藥物治療。 智商處理對自由基介導的氧化作用 壓力， GSH / GSSG比率和非蛋白巰基的 人胰腺癌細胞。 GPx的是另一種含硒蛋白質(zhì)，但硒代殘基不暴露出來。最活躍 TR1的抑制劑，是金諾芬（ Urig和 2022貝克爾）。方法在材料和方法中已經(jīng)描述。為了確定 IQs內(nèi)收的確切部位，這種肽被 MS / MS碎裂，產(chǎn)生的光譜（圖 3D）表明位點是硒代半胱氨酸而不是半胱氨酸殘基。 TR1的 C末端硒代半胱氨酸作為 IQ修飾位點的鑒定 LCMS/ MS法被用來確定 IQs的修飾位點。 NQO2/ NRH本身并不影響這些條件下 TR1活性）。 IQs處理后的凋亡事件的詳細時程也在 MIA PACA2細胞探究；線粒體 中的細胞色素 c釋放到細胞質(zhì)中，在藥物處理 2~4h后被檢測出來（圖 2， C和 D）中，隨后在 4~6h caspase3被激活（圖 2， E和F），在處理 8小時后，細胞凋亡通過膜聯(lián)蛋白 V染色表現(xiàn)，（圖 2， E和 F）。在 4和 72小時處理后， IQ2的 IC 50值分別為 35和 18nM。人類 TR1，其中有一個 C末端的活性位點硒代半胱氨酸殘基，被認為是 IQs的潛在目標。數(shù)據(jù)被表示作為意思 。檢測 Western印跡信號用增強的化學發(fā)光 Western印跡檢測試劑 （通用電氣醫(yī)療集團，查爾方特圣吉爾斯，白金漢郡，英國）。 細胞收集在 RIPA緩沖液補充了蛋白酶抑制劑 cocktail（羅氏診斷，印第安納波利斯， IN）和磷酸酶抑制劑混合物（ GBiosciences公司，圣路易斯，密蘇里州）。 （ 1951）。 細胞中硫氧還蛋白氧化還原狀態(tài)的測定 硫氧還蛋白在細胞的氧化還原狀態(tài)，如前所述方法確定（ Sun and Rigas 2022）。在另一個管中的細胞沉淀物溶解于 120 微升的 5％三氯乙酸，立即
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