【正文】 淀粉酶類屬水解酶中一大類 ， 此類酶包括 α淀粉酶 、 β淀粉酶 、葡萄糖淀粉酶 、 異淀粉酶等 。 功能性低聚糖生產(chǎn)過程一般包括酶的發(fā)酵生產(chǎn) 、 低聚糖的酶法合成 、 分離精制等三個(gè)關(guān)鍵步驟 。 在啤酒生產(chǎn)中 ， 雙乙酰的形成與消除對(duì)促進(jìn)啤酒成熟和縮短發(fā)酵周期起著重要的作用 。 ? 傳統(tǒng)的啤酒后熟工藝需要三周左右的時(shí)間 ， 采用固定化酵母技術(shù)后可大大縮短后熟時(shí)間 ， 只需數(shù)天即可生產(chǎn)出符合產(chǎn)品質(zhì)量要求的啤酒 。 ? 3． 利用超高麥芽糖漿生產(chǎn)結(jié)晶麥芽糖 ? （ 1） 吸附分離法 ? ① 活性炭柱精制法 ? ② 陰離子交換樹脂法 ? （ 2） 有機(jī)溶劑沉淀法 ? （ 3） 膜分離法超濾 、 反滲透均可以分離麥芽糖 ， 得到 96%以上純度的麥芽糖 。 表 46 不同固定化酶的操作穩(wěn)定性比較 ? 固定化酶操作穩(wěn)定性在應(yīng)用中是一個(gè)關(guān)鍵因素 ， 其操作穩(wěn)定性通常以半衰期表示 ， 其含義是指固定化酶活力下降為初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間 。 ? （ 四 ） 提高酶產(chǎn)量的措施 添加誘導(dǎo)物 控制阻遏物濃度 添加表面活性劑 添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑 第三節(jié) 酶的分子修飾 ? 通過各種方法改變酶分子的結(jié)構(gòu) ， 從而使酶的某些特性和功能發(fā)生改變的技術(shù)稱為酶分子修飾 （ molecular modification of enzyme） 。 ? 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方式 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法可分成兩大類 ， 一類是來自血液 、 淋巴組織的細(xì)胞 、 腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞等 ， 可以采用懸浮培養(yǎng)；另一類細(xì)胞來自于動(dòng)物復(fù)雜的器官 ， 具有錨地依賴性 ， 即與其周圍的細(xì)胞互相依存 ， 有所謂 “ 定位依存 ” 關(guān)系 。 70年代后期 ， 出現(xiàn)了固定化細(xì)胞 （ 固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞 ） 技術(shù) 。 ? 該 方 法 的 原 理 是 ： 將 目 標(biāo) 蛋 白 質(zhì) 用pCYB(bioLabs)作為表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá) ， 產(chǎn)生目標(biāo)蛋白 ， 即蛋白內(nèi)含子 /甲殼素結(jié)合蛋白 ， 圖 36 內(nèi)含子介導(dǎo)蛋白質(zhì)分子嵌合體形成 三、融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用 ? （ 一 ） 雙功能酶 (多功能酶 ) 對(duì)于催化連續(xù)反應(yīng)的兩種或幾種酶 ， 可以利用基因融合的方法構(gòu)成的融合蛋白 ， 以催化連續(xù)的反應(yīng) ， 將產(chǎn)生相互增效的協(xié)同效應(yīng) 。 第三節(jié) 體外定向進(jìn)化 一、蛋白質(zhì)的體外定向進(jìn)化 ? 定向進(jìn)化與定位突變的不同點(diǎn)是它不需要已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 ， 所以該技術(shù)又稱為非理性設(shè)計(jì) 。 二、理性分子設(shè)計(jì)和非理性分子設(shè)計(jì) ? 所謂非理性設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化就是在不清楚蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制的情況下 ， 在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬自然進(jìn)化的過程 （ 隨機(jī)突變 、 重組和選擇 ） ，在一定條件下使基因發(fā)生大量變異 ， 然后通過多輪高通量的篩選方法定向選擇出所需要的特性突變物 ， 在較短時(shí)間內(nèi)完成漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化過程 ， 得到具有特性預(yù)期的新蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì)工程技術(shù) 。 1983年 ， 世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物即轉(zhuǎn)抗蟲基因的煙草問世 。 1991年 ， 英國(guó)政府批準(zhǔn)通過了 DNA重組面包酵母工程菌的商業(yè)化應(yīng)用 [7]。 因?yàn)樗鼈兙献鳛檩d體應(yīng)具備的下列條件： ? （ 1） 本身是一個(gè)復(fù)制子 ， 能自我復(fù)制； ? （ 2） 相對(duì)分子質(zhì)量較小 ， ? （ 3） 能給宿主細(xì)胞 （ 受體細(xì)胞 ） 提供可選擇標(biāo)記 ? （ 4） 只有單一限制性內(nèi)切酶切點(diǎn) 一、質(zhì) 粒 ? 質(zhì)粒 （ plasmid） 存在于細(xì)菌 、 放線菌及酵母細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中雙螺旋共 價(jià) 閉 環(huán) 的 DNA （ covalently,closed and circular DNA, 縮 寫 為cccDNA） 。 ? 稀切酶 （ rare cuting enzymes） ， 如表 21所示 ， 同裂酶 （ isoschizomer） 如表 22所示 。 這類酶特別適合于基因工程操作 。 這種復(fù)制 ， 稱為半保留復(fù)制 （ Semi conservative replication） （ 如圖 13） 。 二、生物進(jìn)化論 ? 奧地利學(xué)者格里哥爾 .孟德爾 （ Gregor Mendel） 研究認(rèn)為 ， 遺傳性狀是由一對(duì)遺傳因子決定的 ， 四、摩爾根的基因?qū)W說 ? 摩爾根提出： “ 物質(zhì)必須由某種獨(dú)立的要素組成 ， 正是這些要素我們叫做遺傳因子 ， 或者更簡(jiǎn)單地叫做基因 ” 。 還必須制訂切實(shí)可行的食品安全監(jiān)督管理體系 。 二、食品生物技術(shù) ? 食品生物技術(shù) （ food biotechnology） 是利用生物體及其細(xì)胞 、亞細(xì)胞和分子組成部分 ， 結(jié)合工程學(xué) 、 信息學(xué)等手段去研究及加工處理或制造食品產(chǎn)品的新技術(shù) 。 圖 11 食品生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)疽鈭D 二、食品生物技術(shù)屬邊緣性交叉學(xué)科 ? 生物技術(shù)是研究生命的科學(xué)技術(shù) ， 是生物科學(xué)和工程學(xué)綜合交叉的邊緣學(xué)科 。 六、分子生物學(xué)的誕生 ? 1953年美國(guó)遺傳學(xué)家詹姆斯 .沃森 （ James D .Watson） 和英國(guó)生物物理學(xué)家弗朗西斯 .克里克（ Francis crick） 根據(jù)莫 .休 .弗 .威爾金斯 （ ） 的 x射線衍射等系列圖譜結(jié)構(gòu)分析基礎(chǔ)上 ， 用標(biāo)度分子模型在英國(guó) Max Perutz教授分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究 。 ? （ 4） DNA的調(diào)節(jié)功能 1961年 ， 法國(guó) 分 子 生 物 學(xué) 家 和 （ ）基因調(diào)節(jié)事實(shí) ， 提出了乳糖操縱子 （ Lac Operon） 假說 。 ATG G C CTA??? Asu I識(shí)別 ? EcoR II識(shí)別 ? Mbo I識(shí)別 ? 注： ↑表示切割 5’磷酸二酯鍵位置 。 一、生物學(xué)方法 ? 原核生物中常用鳥槍射擊法或滔彈散射法 （ shotgun cloning） 來克隆分離基因 。 如圖 28所示 [5]。 （三）應(yīng)用于食品的抗菌和防腐保鮮 現(xiàn)將工程菌在食品工業(yè)應(yīng)用較多的菌株如列表 24所示。 依據(jù) T區(qū)攜帶基因功能 ， 可決定植物冠癭瘤的形成和控制冠癭堿的合成 。 通過酶結(jié)構(gòu)或局部構(gòu)象的調(diào)整和改造 ， 可大大提高食品專用酶制劑的耐高溫 、 抗氧化能力 ， 增加酶的穩(wěn)定性和適用 pH 范圍 ， 從而獲得性質(zhì)更穩(wěn)定 、 作用效率更高的酶 。 見圖 35。 國(guó)內(nèi)外已成功構(gòu)建了許多這類的融合蛋白 ， 并在研究中顯示了較好的療效 。 ? 1. 植物細(xì)胞的特性 在動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)中 ， 存在與微生物發(fā)酵顯著不同的地方 ， 應(yīng)予以重視 。 供氧不足時(shí) ， 細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制；氧氣過量時(shí) ， 又會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害 。 第四節(jié) 酶的非水相催化 一、非水相介質(zhì)中酶催化反應(yīng)特性 ? 20世紀(jì) 80年代中期美國(guó)科學(xué)家 Klibanov等人開創(chuàng)性的研究表明 ， 許多酶在非水相中不僅不失活 ， 而且在某些情況下其催化活力與水相中相當(dāng) ， 從而奠基了非水相酶學(xué)的基礎(chǔ) 。 ? 1. α淀粉酶 （ αamylase） α淀粉酶 （ 1,4αDglucan glucanohydrolase， ） 廣泛應(yīng)用于淀粉質(zhì)原料制造葡萄糖 、 高濃度麥芽糖漿及高果糖漿等淀粉糖的工業(yè)生產(chǎn) 。 ? （ 一 ） 低聚果糖酶法轉(zhuǎn)化 ? 低聚果糖的構(gòu)成及酶法合成原理 低 聚 果 糖 （ fructooligosaccharides ） 又 稱 為 蔗 果 寡 糖（ fructosylsucrose） ， 分子間果糖的轉(zhuǎn)移反應(yīng)分兩步進(jìn)行 ， 見圖 46。 雙乙酰的口味界限值很低 ， 僅為 ~， 超過此閾值會(huì)使啤酒帶有不愉快的餿飯味 。 七、酶法應(yīng)用于啤酒的生產(chǎn) ? 在啤酒釀造中利用從黑曲霉 ASP枯草桿菌具耐熱性的 а淀粉酶 ， 米曲霉中的糖化酶以及 Aniger中提取的葡聚糖化酶 ， 可用于糖化過程中促進(jìn)淀粉的水解以及生產(chǎn)酒精含量高 、 熱量低的啤酒 。 圖 45 全酶法生產(chǎn)超高麥芽糖漿典型工藝 ? １ ． 液化 ? ２ ． 糖化 ? （ １ ） 利用糖化型淀粉酶糖化 表 414 幾種鏈霉菌酶的性質(zhì) ? （ 2） 雙酶糖化法 雙酶糖化法是指利用 β淀粉酶和脫支酶協(xié)同作用進(jìn)行糖化 。 不同固定化酶的操作穩(wěn)定性比較見表 46。 調(diào)節(jié)溶氧量的主要方法是調(diào)節(jié)通氣量 、 調(diào)節(jié)氧分壓 、 攪拌轉(zhuǎn)速 、調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間 、 調(diào)節(jié)氣液接觸面積和改變培養(yǎng)液的性質(zhì)等 。 （ 5） 動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)較慢 ， 細(xì)胞倍增時(shí)間為 15～ 100h， 而且原代細(xì)胞繼代培養(yǎng) 50代后 ， 即會(huì)退化死亡 ， 需要重新分離細(xì)胞 。 1969年 ， 日本千煙一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L氨基酸生產(chǎn) L氨基酸 。 方法見圖 36。 利用定位突變的方法將 Trichoderma reesei堿性纖維素酶的 Glu13 Asn179和 Asp194 突變?yōu)?Lys， 其熱穩(wěn)定性得到了提高 。 ? 理性設(shè)計(jì)是在蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾改造 ， 但是 ， 產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)確定 、 具有新功能特性蛋白質(zhì)并不容易 ， 無法滿足對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行分子改良的要求 。 表 28 基因重組技術(shù)改進(jìn)牛奶成分 [18] 三、轉(zhuǎn)基因植物食品 ? 所謂轉(zhuǎn)基因植物食品是指由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的食物或利用轉(zhuǎn)基因植物為原料生產(chǎn)的食品或食品添加劑 。 （ 一 ） 應(yīng)用于提高食品產(chǎn)品的品質(zhì) 第一個(gè)采用基因工程改造的食品微生物為面包酵母（ saccharomyces cerevisiae） 。 圖 27 PCR擴(kuò)增技術(shù)基本原理 第四節(jié) 基因載體 ? 目前 ， 在基因工程中應(yīng)用的基因載體主要是質(zhì)粒 、 病毒和噬菌體 ， 它們都能擔(dān)當(dāng)無性繁殖載體 。 如 Alu I的識(shí)別序列為： ? ? 四 、 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列及反應(yīng)系統(tǒng) ? 限制性核酸內(nèi)切酶在雙鏈 DNA上能夠識(shí)別的特殊核苷酸序列稱為識(shí)別序列 。 ? II型酶分子量較小 ， 大約 20100kD， 是一種簡(jiǎn)單的單功能酶 ， 作用時(shí)無需輔助因子或只需 Mg2+， 能識(shí)別雙鏈 DNA上特異的核苷酸序列 ，同時(shí)專一性強(qiáng) ， 而且其識(shí)別序列與切割序列相一致 。 經(jīng)過自我復(fù)制出來的每一個(gè) DNA分子中的一條鏈被保留下來 。 特別是 1953年 “ DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) ” 的發(fā)現(xiàn) 、 1969年酶固定化技術(shù)的應(yīng)用成果和 1973年基因工程誕生等重大科技成就為標(biāo)志的劃時(shí)代發(fā)展 第五節(jié) 分子生物學(xué)的形成和發(fā)展 一、細(xì)胞學(xué)說 ? 在 19世紀(jì)中時(shí)施萊登和施旺 （ Schwann） 兩位學(xué)者經(jīng)過 20年的研究繪出有關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯圖象和細(xì)胞組成 ， 從而創(chuàng)立了細(xì)胞學(xué)說 。為加強(qiáng)食品安全在食品加工過程除必須嚴(yán)格執(zhí)行 CAC、 HACCP、GMP和 ACP安全體系外 。 第二節(jié) 食品生物技術(shù)研究?jī)?nèi)容 一、食品與基因工程 ? 基因工程又稱遺傳工程 ， 它是在體外將異源 DNA（ 目的基因 ） 與基因載體 （ 質(zhì)粒 、 病毒等 ） 重組成復(fù)制子并轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的過程 。 三、食品生物技術(shù)具有 “ 六高 ” 基本特征 ? 食品生物技術(shù)與其他高新技術(shù)一樣 ， 對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和食品工業(yè)的革新具有 “ 六高 ” 的基本特征：即高效益 ， 高智力 、 高投入 、 高競(jìng)爭(zhēng) 、高風(fēng)險(xiǎn)和高潛力 。 其研究成果 ，在英國(guó) 《 自然 》 雜志上發(fā)表的 《 DNA結(jié)構(gòu) 》 一文 ， 提出了 “ DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 ” 。 圖 14 分子生物學(xué)中心法則 [5] ? 應(yīng)用乳糖操縱子假說 ， 從分子水平上闡明基因控制蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)合成另一種酶合成調(diào)節(jié)與酶的誘導(dǎo)合成機(jī)制不同 ， 稱為酶的反饋?zhàn)瓒?。 ? ? ， 按其切割雙鏈的方式可分兩種：粘性末端和平整末端 。 此法優(yōu)點(diǎn)是：快速簡(jiǎn)便 、 產(chǎn)物純度高 ， 是真正的天然基因 ，兼有外顯子和內(nèi)含子 。用小寫英文字母 P代表質(zhì)粒 ， BR表示該質(zhì)粒 研究者 Bolivar 和Rogigerus， 而 322是具體研究編號(hào) 。 表 24 基因工程改良的微生物工程菌 工程菌名稱 改造的方式 用 途 Lactobacillus 修飾細(xì)菌素合成 乳制品生產(chǎn)、無污染物質(zhì)生產(chǎn) Lactococcus 修飾蛋白酶活性 乳制品生產(chǎn)加速干酪熟化 避免噬菌體感染 提高菌種穩(wěn)定性 修飾溶菌酶合成 干酪生產(chǎn)，預(yù)防雜菌感染 Saccharomyces 葡聚糖酶基因?qū)奁【平湍钢斜磉_(dá) 啤酒生產(chǎn)，縮短發(fā)酵時(shí)間 Cerevisiae 飾豌豆脂肪氧化酶 增強(qiáng)面團(tuán)流變學(xué)物性及穩(wěn)定性 Saccharomyces Carlsbergensis 修飾來自 Enterobacter aerogenes或 Acetobacter pasteurianus的a乙酸乳酸脫羧酶基因 縮短釀造周期 修飾來自 Aspergieeus niger 的葡萄糖淀粉酶基因 應(yīng)用于淀粉降解和低熱量啤酒的生產(chǎn) 修飾來自 Schwanniomyces occidentalis的淀粉酶和葡萄糖淀粉酶 應(yīng)用于淀