【正文】 轉(zhuǎn)化子可以在4 ℃下保持1個(gè)月；10）單菌落培養(yǎng)：用滅菌的牙簽，挑選白色的單菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液體LB培養(yǎng)基的50 ml離心管中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)過(guò)夜（1216 h）。Template DNA2ul（20ng）10buffer MgCl2（25mM） Primer F（10uM） Primer R（10uM） dNTPs（2mM） Taq（5U/ul） Add ddH2O to20ulPCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：95℃3min1cycle 94℃1min55℃1min 72℃90s35cycles 72℃10min1cycle 4℃forever檢測(cè)：加2ul溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳在1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳；EB染色，紫外觀察。取制備的質(zhì)粒DNA 12ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%。乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。g DNA，37℃消化過(guò)夜，TBE，%。二、實(shí)驗(yàn)原理植物的遺傳物質(zhì)是DNA，植物細(xì)胞內(nèi)含有豐富的遺傳物質(zhì)。配好后室溫放置一段時(shí)間，再放入冰箱中冷藏保存。四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時(shí)要求同學(xué)們認(rèn)真記錄，不要隨意動(dòng)手，以保證儀器和人身安全。，就最終對(duì)胚搶救成活及成苗率影響大小而言，所利用的組織優(yōu)劣順序是：＿、＿、＿、＿。三、填空題：將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內(nèi)，兩者用“，”隔開(kāi)。 gene silencing culture hybridization二、判斷下列各題正確與否，正確的填“Y”錯(cuò)誤的填“N”。，其中我國(guó)首先報(bào)道的有40多種。，往往不能進(jìn)行高壓滅菌，通常采用過(guò)濾滅菌，即先將除去了這些不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基的其他成份經(jīng)高壓滅菌后放置于無(wú)菌場(chǎng)所，若制備半固態(tài)培養(yǎng)基，須待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右，再加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的各種不耐熱成分溶液，再混勻放置，分裝備用。、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。，即＿、＿、＿、＿、＿等。、類病毒、植原體、螺原體和韌皮部及木質(zhì)部限制性細(xì)菌等。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟調(diào)整模板濃度至5ng/ul。加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，置于冰上35min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS蛋白復(fù)合物沉淀）。TE:10mM TrisHCl（pH ），1mM EDTA（pH ）。通過(guò)離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA?？傊D(zhuǎn)基因植物的廣泛種植可以顯著降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率；可以有效緩解人類的糧食問(wèn)題、能源問(wèn)題；可以大大提高人類的生活質(zhì)量和健康水平；可以有效增加可利用的土地資源，擴(kuò)大綠地植被面積，減少土地的沙漠化和鹽堿化，減少環(huán)境污染，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。⑦引物自身：引物自身不存在連續(xù)4個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，否則會(huì)影響到引物與模板之間的結(jié)合，尤其避免3’端的互補(bǔ)。主要過(guò)程：①反應(yīng)體系，包括模板DNA、SSR引物、10PCR緩沖液、dNTP、Tap 酶和ddH2O；②反應(yīng)過(guò)程包括預(yù)變性、變性、退火、延伸，在PCR儀上進(jìn)行；③將PCR產(chǎn)物在測(cè)序電泳儀上用5%聚丙烯酰胺凝膠分離，DNA染色采用銀染法。5．藍(lán)白斑篩選：藍(lán)白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。如加拿大發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜與野生近緣種間發(fā)生過(guò)交叉雜交,從而形成所謂超級(jí)雜草，導(dǎo)致野生等位基因的丟失，從而造成遺傳多樣性的喪失，影響生態(tài)平衡。例如20世紀(jì)80年代初期由我國(guó)學(xué)者周光宇提出的，我國(guó)目前推廣面積最大的用花粉管通道法培育出來(lái)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，是對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)人類有利的最好的證明。但是他們又有本質(zhì)上的區(qū)別：傳統(tǒng)技術(shù)只能在生物種內(nèi)個(gè)體間實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)所轉(zhuǎn)移的基因則不受生物體間親緣關(guān)系的限制；傳統(tǒng)的雜交和選擇技術(shù)一般是在生物個(gè)體水平上進(jìn)行，操作對(duì)象是整個(gè)基因組，所轉(zhuǎn)移的是大量的基因，不可能準(zhǔn)確地對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行操作和選擇，對(duì)后代的表現(xiàn)預(yù)見(jiàn)性較差。該技術(shù)可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育出新品種。在傳統(tǒng)作物中植入快速生長(zhǎng)基因后，農(nóng)作物的特性得到了改善，不僅可縮短生長(zhǎng)期而且還增加作物產(chǎn)量，使土地得到了最大限度的充分利用，也使人類從此告別缺糧的歷史。在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)20周的觀察之后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品影響了小鼠的生殖能力,《俄羅斯科學(xué)家證實(shí)轉(zhuǎn)基因食物是有害的》。參考文獻(xiàn)(1)文平，[J].生物學(xué)教學(xué)，(2)Russia says genetically modified foods are harmful(3)[J].,27(4)[J].(5)[J]攀枝花學(xué)院學(xué)報(bào)。③DNA聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。答：PCR反應(yīng)中引物設(shè)計(jì)原理為：①選擇合適的靶序列：設(shè)計(jì)引物之前，必須分析待測(cè)靶序列的性質(zhì)，選擇高度保守、堿基分布均勻的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。因此，人們將以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的生物技術(shù)上的巨大飛躍譽(yù)為第二次“綠色革命”。五、思考題根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項(xiàng)。溶液I: 50mM葡萄糖，25mM TrisHCl（pH ），10mM EDTA（pH ）。16loading buffer（上樣緩沖液）:%溴酚藍(lán)，%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。實(shí)驗(yàn)三 PCR技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康木酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。，其中我國(guó)首先報(bào)道的有40多種?！疉TCG TACG GGTT3’，則能與其互補(bǔ)配對(duì)的另一條鏈可能是：（）A：5’ATCG TACG GGTT3’ B：5’AACC CGTA CGAT3’ C：3’TAGC ATGC CCAA5’ D：3’UAGC AUGC CCAA5’:（）A：血清學(xué)檢測(cè) B：PCR檢測(cè) C：同工酶檢測(cè) D：指示植物鑒定：()A：酒精消毒 B：HgCl2消毒 C：NaClO消毒 D：NaCl消毒：（）A：對(duì)稱融合 B：非對(duì)稱融合 C：配子—體細(xì)胞融合 D：：（）A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：熒光素酶基因：（）A：兩側(cè)的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ ：（）Ａ：誘導(dǎo)莖細(xì)胞的伸長(zhǎng) Ｂ：對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響 Ｃ：可以解除種子、塊莖、鱗莖等休眠 Ｄ：抑制衰老，下列可能是遺傳物質(zhì)的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖：()A：熱處理脫除病毒 B：莖尖培養(yǎng)脫除病毒 C：微芽嫁接脫除病毒 D：高壓滅菌脫除病毒：（）Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態(tài) most important contribution of Watson and Crick is:()A：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型 B：RNA結(jié)構(gòu)模型 C：DNA是遺傳物質(zhì) D：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)：（）A：形態(tài)學(xué) B：細(xì)胞學(xué) C：電子顯微鏡觀察法 D：遺傳標(biāo)記：（）A：同源序列法 B：圖位克隆法 C：功能克隆法 D：差減雜交法:()A：有性雜交 B：體細(xì)胞雜交 C：組織培養(yǎng) D：基因克?。海ǎ〢：繪制品種的指紋圖譜B：種質(zhì)資源的遺傳多樣性及分類研究 C：物種的起源與演化 D：種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、鑒定與創(chuàng)新：（）A：免疫注射 B：細(xì)胞融合 C：篩選 D：克隆化’ATCGTACGGGTT3’，下列虛線部分為500—1000 pb長(zhǎng)的DNA區(qū)域，請(qǐng)分析其中能進(jìn)行2的指數(shù)倍擴(kuò)增的有：()A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’，長(zhǎng)方形是探針結(jié)合部位，試問(wèn)3三種DNA樣品用該酶/探針組合進(jìn)行RFLP分析能得到的雜交信號(hào)條帶數(shù)分別是：A： 1 B：2 C：1 D：2 ：（）Ａ：原生質(zhì)體來(lái)源 Ｂ：基因型 Ｃ：培養(yǎng)基 Ｄ：滲透壓調(diào)節(jié)劑：（）Ａ：種質(zhì)資源保存 Ｂ：原生質(zhì)體融合 Ｃ：篩選突變體 Ｄ：遺傳轉(zhuǎn)化五、簡(jiǎn)答題：將下列各題的答案填在下面的方框內(nèi)。、GUS、Ant、Luc、AFLP等。，影響原生質(zhì)體的主要因素有＿、＿、＿、＿。？。，而花粉培養(yǎng)則屬于器官培養(yǎng)的范疇。，已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍(lán)、蕃茄、柑橘等植物的原生質(zhì)體再生植株中觀察到變異，再生植株產(chǎn)生的變異主要有＿、＿、＿、＿。、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。配制過(guò)程中產(chǎn)生沉淀的原因有：； 值過(guò)高，可加幾滴鹽酸校正。七、思考題影響植物組織培養(yǎng)的因素有哪些？主要參考文獻(xiàn)，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。：向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1TE，37℃水浴1530分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時(shí)，然后加入700 181。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過(guò)程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時(shí)配制。，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過(guò)程。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR產(chǎn)物TA克隆的原理，學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化及回收，以及PCR產(chǎn)物與TA克隆載體的連接。實(shí)驗(yàn)五 PCR技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康木酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。（二）實(shí)驗(yàn)步驟取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過(guò)夜培養(yǎng)。高壓滅菌15min，貯存于4℃。質(zhì)粒的分離與提取時(shí)最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base， h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｍ庵搀w消毒及接種操作要規(guī)范，注意超凈臺(tái)的衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。KNO395 g NH4NO3 g KH2PO g MgSO4?7H2O g CaCl2?2H2O g 注意事項(xiàng)：（1）配置母液前要仔細(xì)清洗存儲(chǔ)容器（2）應(yīng)按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動(dòng)存儲(chǔ)瓶使其混合均勻；（3）溶解時(shí)最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生；（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因?yàn)樗袔Ь窟^(guò)大而產(chǎn)生沉淀，同時(shí)可以減緩綠藻的生成；（5）沉淀的產(chǎn)生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時(shí)一定不要急；二是由于長(zhǎng)菌而產(chǎn)生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。？，現(xiàn)欲建一園藝植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，請(qǐng)簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)室的布局及主要的儀器設(shè)備六、綜述題：將下列各題的答案寫(xiě)在下面的方框內(nèi)。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。、＿、＿等四種。，常采用酶解的方法脫除細(xì)胞壁。_______標(biāo)記和_______標(biāo)記等四種不同水平的標(biāo)記。、＿、＿等。質(zhì)粒電泳檢測(cè)一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線型三種構(gòu)型。高壓滅菌15min，貯存于4℃。IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過(guò)濾滅菌后20℃保存。每班分為兩小組簡(jiǎn)要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的布局及功能分區(qū)情況；針對(duì)每個(gè)分區(qū)的重要儀器進(jìn)行講述，結(jié)束時(shí)對(duì)所有參觀內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問(wèn)。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，進(jìn)行植物品種的改良、新品種的培育以及作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物藥物和疫苗等。④ 將上清液移至新的離心管，顛倒混勻后放置15min，10000 r/min離心5min，棄上清液。答：基因工程中常用的工具酶有：①限制性核酸內(nèi)切酶：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能