【正文】 10:55:4810:55:4810:55Wednesday, March 24, 20231知人者智，自知者明。 24 三月 202310:55:48 上午 10:55:48三月 211比不了得就不比，得不到的就不要。單菌落保存于 96孔平板中利用 YAC載體構(gòu)建基因組文庫酵母人工染色體構(gòu)建（ 4） SMART3.vectorHighbacterialISacRNA除去 RNA限制酶切除去 2） G引物的合成：在質(zhì)粒上進(jìn)行，用于合成第二條 cDNA鏈DNAofvectorλBGGATCby★ fragmenttheλvectorscloneagenethemethylaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCAdd EcoR Ilowabundanceplasmids.31)dT,addedsinglestrandedtailingCCGAATTCGGGGCTTAAGCCLinkers:plasmidconcatemersDNA.MainCCsucrosegradientdsT3’S1TS1templeReversearebinanthost/vectorasingleplasmidLigation理論上隨機(jī)排列的 9bp片斷可區(qū)分 262DNA減法雜交和 mRNA減法雜交。19gene 利用 EST尋找新基因的策略即為表達(dá)序列標(biāo)簽法（ ESTs）。Linker氰乙基 亞磷酰胺。11分離步驟：基因文庫 探針序列 QUNGUNUUQCAQGAQGCN如： LeuValPheHisAspAla轉(zhuǎn)化細(xì)胞（ leu2/LEU2， Leu+） →LEU2 基因基因組文庫 DNA必備條件：外源基因不僅能在受體細(xì)胞表達(dá)，而且必須具備生物學(xué)活性。如哺乳動物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中珠蛋白 mRNA占總 mRNA的 90%以上，用此法克隆了該基因。利用多肽鏈制備的抗體及二抗，與多聚核糖核蛋白體一起溫育，目的基因的多聚核糖核蛋白體將通過抗原抗體反應(yīng)與相應(yīng)抗體形成復(fù)合物，利用不連續(xù)蔗糖梯度離心將此復(fù)合物分離出來，再通過酚 /仿抽提法出去蛋白質(zhì)部分，過oligodT柱層析，即可分離出特定蛋白編碼的 mRNA，反轉(zhuǎn)錄即可得到 cDNA。目的基因制備方法有直接分離法、基因文庫篩選法、 PCR擴(kuò)增法以及化學(xué)合成法等。KeyGeicGuizhou2） 掌握常作 DNA聚合酶的特性和用途。② →P： AG32種 14聚體的混合物，其中必有一種與待測 DNA完全互補(bǔ)。有磷酸二酯法、磷酸三酯法和亞磷酸三酯法，反應(yīng)體系有液相和固相。2）偶聯(lián)反應(yīng)（縮合反應(yīng)，加成反應(yīng)） 固定的是探針，或者是靶 DNA分子。）的測定。salking)及整合后可獲得全長的 cDNA9）種轉(zhuǎn)錄物，人類的基因約僅有 80 gene第二節(jié) shearing2）加到載體上：選擇寄主和載體系統(tǒng)平末端連接 intoDNAGenerationhostterminiTransformationthe如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等HousekeepingcDNA:removeAfragmentATT（ dG） primeddestroy(klenowprocess,produceBAPthe1)sequencewithdigestionissiteEnzyme digestionTerminal transferase + dCPst I digestionTerminal transferase + dGDNAthehandlenumbermoretoexamineconstructingcollectionanisms選擇哪種載體用于基因組文庫構(gòu)建？ Which vector is used to choose for construction of geic library?λweighttheweightbeSau3A–cutend Sau3Athethewith誘導(dǎo)型啟動子在原核生物中（ In prokaryotic promoter）：Consensus sequence: In prokaryotic promoter, two main regions is important:10 region= Pribnow box: 5’TATAAT3’35 region: 5’TTGACA3’真核生物中（ InI1)PstIin2.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法Templates) 1) 當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶合成到 mRNA模板 5’端后，它會在第一鏈的 3’端加上幾個 C；2) 合成的寡核苷酸 G與 C配對；3) 反轉(zhuǎn)錄酶以新合成的 cDNA為模板，繼續(xù)合成第二條 cDNA鏈；4) LD PCR—Long Distance PCRtRNA代謝或發(fā)育特異性 Ligase的特點。 24 三月 202310:55:48 上午 10:55:48三月 211楚塞三湘接， 荊門 九派通。POWERPOINTLorem ipsum dolor sit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blanditut cursus. 感謝您的下載觀看專 家告 訴。 10:55:4810:55:4810:55Wednesday, March 24, 20231不知香 積 寺，數(shù)里入云峰。不均勻性mRNA ， 80—85%of4.500kbDNAIHind弱啟動子Induciblearee.4）第二條 cDNA鏈的合成：cloningbyCTAGE B S E B SLeft arm Right armStuffer fragmentS SLeft arm S/BGATCCTAGGATCCTAGS/B Right armInsert DNASau3AofFragmentationDNAtolinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvector vector1) The1）文庫規(guī)模 隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)粒DNA，電泳測定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計算文庫大小。重組 DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫的擴(kuò)增forlibrarylibraries★ aimtheoftenmayastorewhichmolecule.Pst IvectorCCCCCCCC3’3’CCCCCCCCInsertCTGCAGGGGGGGG3’G3’GGGGGGGGACGTCGPst IterminalcloninginacohesivedisappearselfligateanDNAS1oligo(dG)primerChapterTAcDNADNAAmRNA ChapterH)mRNA Chaptermetabolism），表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，在各生長階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。geneofintorequirementsA.rebinant機(jī)械剪切 enzyme,analysis以這兩種總 mRNA（或是它們的 cDNA理論上隨機(jī)排列的 9bp片斷可區(qū)分 262程序?qū)⑺鼈兤唇映梢粋€ EST從組織特異性或細(xì)胞特異性的 cDNA文庫中隨機(jī)挑選克隆，進(jìn)行 5‘端和 3’端部分序列（約 400DNA③ 用 RNA亞磷酸胺單體和聚苯乙烯固相載體，合成 RNA。用三氯乙酸（TCA）或二氯乙酸（ DCA）處理，脫去連在固相載體上的核苷酸或寡核苷酸 5`羥基的 DMT保護(hù)基團(tuán)。6．特異性 DNA片段 (基因 )的 PCR擴(kuò)增 N： ACGT/U（ 2)→8篩選基因文庫的方法：① 64．利用酶促反轉(zhuǎn)錄直接從特定 mRNA分離基因?qū)?DNA切割成適當(dāng)片段，富含 GC的雙鏈DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速離心技術(shù)，可將 DNA片段按不同密度大小分開。GeneLifeTechnologyof無論是已知序列或是尚未測序的序列都可進(jìn)行分離，只要確定目的基因兩側(cè)的酶切位點，就可用相應(yīng)的酶進(jìn)行切割，獲得目的基因。A代替二抗，再用 protein基因文庫分基因組文庫和 cDNA文庫?！?轉(zhuǎn)化細(xì)胞可在纖維素平板上形成水解圈 →雜交斑點（陽性克?。?→ 分離重組 DNA分子 固相載體：是對 DNA合成試劑惰性的物質(zhì)，目前采用可控孔徑的玻璃沙（ CPG） ,其表面的硅氧烷鍵可與 A、 G、