【正文】 圖4 馬鈴薯腐爛莖線蟲熱激蛋白與秀麗小桿線蟲熱激蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果Figure 4 The alignment result of heat shock protein of with HSP proteins of 橫線：三段保守的HSP70家族簽名序列（IDLGTTS、DLGGGTFDSL、LVGGRPK）；方框：胞質(zhì)型HSP70 C末端標(biāo)志性滯留信號基序（EEVD）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型HSP70 C末端標(biāo)志性滯留信號基序（KDEL）、線粒體型HSP70保守基序（GDAW）。采用HSP70FF和HSP70FR引物（表1），以馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3E），回收、測序后獲得了長度為4323bp的基因組全長序列。C末端包含12bp的poly（A）尾巴，其上游含有一段加尾信號“AATAAA”。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。 DdHsp70C基因3′ RACE根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70C基因核心片段序列，采用Primer Premier ′ RACE 引物：HSPBSP1：5′TGACGATTTCAACGGTCTTTAC3′HSPBSP2：5′TTCGTCGTCGAGTTCCTCATC3′′ 第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。l總體積 50 181。lcDNA模版 2 181。M） 2 181。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照GeneRacerTM RACE Kit說明書進(jìn)行。l解凍后的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min；（2） 42 ℃水浴熱激45 s（勿動）；（3） 立即取出冰浴12 min；（4） 往每管加入不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基890 181。lPCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s59 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 1 min72 ℃ 10 min%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠（EB）染色，膠在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并照相，將目的條帶用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，連接到pMD174。lRNase Free dH2O 181。lOligo dTAdaptor Primer 181。 方法 馬鈴薯腐爛莖線蟲總RNA的提取線蟲總RNA的提取采用TRIzol法，步驟如下：（1）將皿蓋上分離下的馬鈴薯腐爛莖線蟲用滅菌水洗滌3次， ml Eppendorf離心管中，立即加入1 ml TRIzol溶液，反復(fù)搖勻；（2）將離心管在液氮和37℃水浴中交替放置30s，反復(fù)凍融67次；（3）將上述離心管在室溫下靜置5 min，再使用高速冷凍離心機(jī)4 ℃ 12000 rpm離心10 min；（4）將上述所得上清液小心吸取轉(zhuǎn)入另一新離心管中， ml氯仿，反復(fù)振蕩搖勻，室溫下靜置10 min；（5）將上述離心管放入高速冷凍離心機(jī)中，4 ℃ 12 000 rpm離心15 min；（6）用移液槍小心吸取上層水相置于新的離心管中， ml異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10 min；（7）上述離心管置于高速冷凍離心機(jī)4 ℃ 12 000 rpm離心10 min后棄上清，沉淀用1 ml DEPC水處理過的75%無水乙醇漂洗兩次。其他生化試劑購于美國Sigma公司或國產(chǎn)分析純。土壤線蟲對生存環(huán)境的變化具有很高的敏感性，具有對環(huán)境的各種變化包括低劑量化合物能做出較迅速的應(yīng)對反應(yīng)等特點(diǎn)。Hsp70具有以下三種生化特性：（1）它們的氨基端存在弱的ATPase活性；（2）當(dāng)ATPase被激活時(shí)，它們可與伸展的多肽進(jìn)行結(jié)合；（3）它們亦可保護(hù)各種酶免受熱激破壞，使聚合的蛋白質(zhì)解聚（Daugaard el a1．，2007）。如氨基甲酸醋類有克百威、涕滅威等，有機(jī)磷類有丙溴磷、丙線磷、甲基異柳磷等，大環(huán)內(nèi)醋類有阿維菌素等。雌蟲：蟲體為線形，側(cè)線6條，熱激殺死后蟲體略向腹面彎曲。馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）是引起植物病害的重要病原物之一，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失。殺線蟲劑施用后主要以低劑量的形式存在于土壤中。頭部低平、略縊縮，口針有顯著的基部球，中食道有瓣，呈紡錘形，后食道腺短，覆蓋腸的背面，偶爾縊縮。線蟲一般分布于土層，非熏蒸類藥劑的施用主要有根苗浸漬、拌種、溝施和灌根等方法，未降解的藥劑主要?dú)埩粼谕寥乐?，化學(xué)農(nóng)藥的長期施用對線蟲也將產(chǎn)生一定的影響，產(chǎn)生抗藥性便是其中的一個(gè)方面，2007年丁中等發(fā)現(xiàn)，河北涿州、(丁中等,2007)。 脅迫因子在自然界，所有生物均不可避免地遭受各種脅迫因子的影響?；瘜W(xué)藥劑的防治目前仍然是植物寄生線蟲綜合防治中重要的手段之一。LB培養(yǎng)基：酵母提取物（5 g/L），NaCl（10 g/L），胰蛋白胨（10 g/L），用1 mol/L 。（8）上述離心管7500轉(zhuǎn)，離心5min后棄上清，將沉淀的RNA在室溫下自然干燥，使得乙醇完全蒸發(fā)；（9）最后加入22 181。lTotal RNA (500 μg/181。l總體積 10 181。18T載體中，隨后轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌細(xì)胞中。l；（5） 上述溶液于37 ℃，200 rmp震蕩培養(yǎng)1 h，使細(xì)菌恢復(fù)活性；（6） 取200 181。PCR反應(yīng)體系和條件如下：（1）Outer PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系：1 cDNA Dilution BufferⅡ 5 181。l3′ RACE Inner Primer（10 181。lEx Taq酶（5 U?181。lPCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s54 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 2 min72 ℃ 10 min反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。其中Outer PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為60 ℃，延伸時(shí)間定為2 min；Inner PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為59 ℃，延伸時(shí)間定為2 min。 DdHsp70F基因5′ RACE根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70F基因核心片段序列，采用Primer Premier ′ RACE 引物：SL1：5′GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG3′H70FR5：5′TCCTTGGTAGCTTGTCTTTGAG3′。結(jié)果表明本研究克隆的馬鈴薯腐爛莖線蟲Hsp70基因?yàn)橐粋€(gè)完整基因，將cDNA序列命名為DdHsp70A，GenBank登錄號：KF792307。采用GSDS在線軟件進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明DdHsp70F基因組由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，符合GT/AG剪切規(guī)律。黑色區(qū)域：線蟲高度保守的氨基酸；DDHSP70A：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AHF71091）；CEHSP1：秀麗小桿線蟲（NP_503068）；DDHSP70C：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AFL69919）；CEHSP3：秀麗小桿線蟲（NP_509019）；DDHSP70F：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AFL69920）；CEHSP6：秀麗小桿線蟲（NP_504291）Underlineed：Three conserved motifs of the HSP70 family（IDLGTTS、DLGGGTFDSL、LVGGRPK）；Box：The cytoplasmic HSP70 carboxyl terminal region（EEVD）、The endoplasmic reticulum HSP70 carboxyl terminal region（KDEL）、conserved motif of mitochondrial HSP70（GDAW）.Black blocks：Conserved amino acids across all nematode. DDHSP70A:（AHF71091）。，結(jié)果如圖4所示。將此cDNA序列命名為DdHsp70F，GenBank登錄號：JQ422277。使用NCBI在線軟件ORF finder分析，結(jié)果表明，該序列包含1個(gè)長度為1938bp的開放閱讀框（ORF），編碼了645個(gè)氨基酸，5′端起始密碼子“ATG”前存在45bp的非編碼區(qū)（UTR），3′端終止密碼子“TAA”后存在98bp的非編碼區(qū)（UTR）。其中Outer PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為55 ℃， min；Inner PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為51 ℃， min。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。l雙蒸水 181。M） 3 181。l701GSP2（10 181。 DdHsp70A基因3′ RACE根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70A基因核心片段序列，利用Primer Premier ′ RACE 引物：701GSP1：5′CGATGCGAAGCATTTGATTG3′701GSP2：5′GCGAATCATAAACGAGCCTACTGC3′′端cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。轉(zhuǎn)化步驟：（1） 將上述連接反應(yīng)產(chǎn)物加入到100 181。l總體積 50 181。l) 1 181。lReverse transcriptase MMLV 0. 5 181。2H2O ， g Tris ml 冰醋酸，充分溶解混勻后滅菌備用。18T載體、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit、EX Taq DNA聚合酶、SYBR Premir EX Taq以及DNA Marker購于大連寶生物工程有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞以及瓊脂糖膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。3 本研究的目的和意義線蟲是土壤中廣泛存在的無脊椎動物，它在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要功能。同時(shí)，HSP70家族存在三段簽名序列：IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPK（Ravaux J el a1．，2007），這些研究依據(jù)均可用于Hsp70的確定。用于防治植物寄生線蟲的化學(xué)藥劑主要為非熏蒸類，如氨基甲酸酯類、有機(jī)磷類、大環(huán)內(nèi)酯等化合物。（Nematoda）、線蟲綱（Nematoda）、墊刃目（Tylenchida）、墊刃總科（Tvlenchoidea）、粒線蟲科（Anguinidae）、粒亞科（Anguininae）、莖線蟲屬（Ditylenchus）（FiliPjev，1936）（謝輝，2005)。（保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日摘 要熱激蛋白70（Heat shock proteins，Hsp70s）是熱激蛋白家族中最重要的一類家族成員，廣泛存在于原核生物和真核生物的細(xì)胞區(qū)室和器官中，其序列高度保守。本研究采用RTPCR和RACE技術(shù)克隆了馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）三個(gè)熱激蛋白70基因，分別命名為DdHsp70A（GenBank登錄號KF792307）、DdHsp70C（GenBank登錄號JQ422276）和DdHsp70F（GenBank登錄號JQ422277），并利用Realtime PCR檢測了馬鈴薯腐爛莖線蟲經(jīng)低劑量（）殺線蟲劑阿維菌素、丙溴磷和涕滅威處理24h后，三個(gè)熱激蛋白70基因表達(dá)量的變化。前伸性單卵巢，有的可伸達(dá)食道區(qū)，后陰子宮囊較長，是肛陰距離的40%98%。目前，殺線蟲劑對線蟲的毒理學(xué)研究主要在高劑量或常量處理下進(jìn)行研究，然而，由于其施用方法主要為土壤處理，這就使得大部分殺線蟲劑殘留在土壤環(huán)境中。脅迫（stress）在生物學(xué)意義上是指環(huán)境對生物的一種逼迫和壓力狀態(tài)；脅迫因子則是指那些超出正常變動范圍的生態(tài)因子。用于防治植物線蟲的化學(xué)藥劑主要是非熏蒸類，如大環(huán)內(nèi)酯的阿維菌素、有機(jī)磷類的丙溴磷、氨基甲酸酯類的涕滅威等幾類化合物。PDA培養(yǎng)基(L)：馬鈴薯去皮，切片，稱取200 g蒸餾水煮沸20 min，用沙漏過濾，濾液中加入15 g瓊脂、18 g葡萄糖，再用蒸餾水定容至I L，錐形瓶分裝后高壓蒸汽滅菌，備用。l無RNAase的純水重懸干燥后的RNA，于80℃?zhèn)溆茫?馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA的提取馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA的提取采用DNA提取試劑盒（QIAGEN）進(jìn)行，操作方法依照說明書進(jìn)行，具體步驟如下：（1）收集皿蓋上新鮮的馬鈴薯腐爛莖線蟲，滅菌水洗滌3次，液氮中充分研磨成粉末后轉(zhuǎn)入到2 ml tube離心管中；（2）加入180 181。l) 1 181。l將上述反應(yīng)混合物于42 ℃反應(yīng)60 min以完成cDNA第一鏈的合成。瓊脂糖凝膠DNA回收步驟如下：（1）柱平衡步驟：加入500 181。l菌液均勻涂布在LB平板上（含氨芐青霉素100 μg/ml，IPTG 100 μg/ml，Xgal 200 μg/ml），37 ℃倒置培養(yǎng)1216 h；（7） 小心挑取白色菌落至10 ml 的LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/ml）中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃，200 rmp震蕩培養(yǎng)1216 h。l10 PCR EX BufferⅡ（M