【正文】 。、腐生線蟲(chóng)Panagrellus redivivus hsp70C、豬蛔蟲(chóng)Ascaris suum hsp703的氨基酸序列的同源性分別為92%、91%、86%和84%。 DDHSP70F：（AFL69920）。 DDHSP70C:（AFL69919）。氨基酸序列含有被作為線粒體Hsp70標(biāo)志的一個(gè)保守基序GDAW（123126殘基），該基序是線粒體和變形細(xì)菌特有的，因此推斷該蛋白存在于線粒體中（圖4）。DdHsp70A推導(dǎo)的氨基酸序列包含HSP70家族3個(gè)完整的典型基序（motif）：1017（IDLGTTYS）；199212（IFDLGGGTFDVSIL）；336347（IVLVGGSTRIPK）。 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)DdHsp70F基因克隆使用簡(jiǎn)并引物HSPFF和HSPRR（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收、測(cè)序得到長(zhǎng)度為450bp的序列（圖3A），根據(jù)該片段序列設(shè)計(jì)3′RACE引物HSPASP1和HSPASP2，以及5′端RACE引物H70FR5（表1）進(jìn)行3′RACE和5′RACE擴(kuò)增，回收、測(cè)序后分別得到1856bp（圖3B）和593bp（圖3C）的序列，序列拼接最后得到核苷酸長(zhǎng)度為2092bp。采用GSDS在線軟件進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明DdHsp70A基因組由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成（圖1F），符合GT/AG剪切規(guī)律。2 結(jié)果與分析 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)Hsp70基因的克隆 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)DdHsp70A基因克隆使用簡(jiǎn)并引物HSP70AF和HSP70AR（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條特異性條帶（圖1A），回收、測(cè)序得到長(zhǎng)度為564bp的序列，BLAST比對(duì)結(jié)果表明，與秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans HSP松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus、麥地那龍線蟲(chóng)Dracunculus medinensis等熱激蛋白基因相似度分別為91%、91%和89%。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測(cè)序。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測(cè)序。 DdHsp70C基因5′ RACE根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)DdHsp70C基因核心片段序列，采用Primer Premier ′ RACE 引物：SL1：5′GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG3′H70C2R5：5′TGGGCATCATTGAAGTAAGCAG3′。l雙蒸水 181。ldNTP Mixture（10 mM） 4 181。M） 3 181。l雙蒸水 181。ldNTP Mixture（10 mM） 4 181。lMgCl2（25 mM） 5 181。l雙蒸水 181。l701GSP1（10 181。l1） 181。對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液采用通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)：M13F（47）：5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3′M13R（48）：5′AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3′PCR反應(yīng)體系：10 PCR EX Buffer 5 181。l回收DNA 4 181。l平衡液BL至吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm離心1 min，棄廢液后將吸附柱重新放回收集管中；（2）將目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入一個(gè)干凈的離心管中，稱(chēng)取凈重量；（3）往離心管中加入3倍體積的溶膠液PN（如瓊脂糖凝膠凈重為1 g，其體積可視為1000 181。lcDNA模版 2 181。70 ℃ 15 min去除反轉(zhuǎn)錄酶活性。l) 181。lRNase free ddH2O 181。PCR反應(yīng)體系和條件如下： PCR反應(yīng)體系： MgCl2 2 181。l Buffer GL、10 181。M 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，于20℃保存?zhèn)溆?。DEPC處理水：將2 % DEPC的蒸餾水中過(guò)夜處理，然后高壓蒸汽滅菌； mL DEPC，搖勻后高壓蒸汽滅菌，備用。本文采用SL1序列擴(kuò)增抗氧化酶基因5′ 端，結(jié)合RTPCR和RACE技術(shù)克隆了馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)DdHsp70A、DdHsp70C和DdHsp70F基因。由于非熏蒸類(lèi)殺線蟲(chóng)劑的施用方法主要是土壤處理，使得大部分殺線蟲(chóng)劑殘留在土壤環(huán)境中，在土壤環(huán)境中具有生物活性的農(nóng)藥往往以低劑量形式存在。 Hsp70的表達(dá)需要代價(jià)除非環(huán)境條件突然變得殘酷起來(lái)，否則生物是不表達(dá)Hsp70的，隨時(shí)都會(huì)出現(xiàn)的環(huán)境波動(dòng)也不能誘導(dǎo)Hsp70的表達(dá)，因?yàn)樯镌趹?yīng)對(duì)脅迫生境時(shí)體內(nèi)Hsp70的表達(dá)累積是需要付出細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖為代價(jià)的（Feder et al．，1992；Krebs amp。它們通常作為限制因素影響生物的生長(zhǎng)發(fā)育、生存和生理功能，從一定程度上形成了生物有機(jī)體的選擇壓力和進(jìn)化動(dòng)力。其中，位于C末端的結(jié)構(gòu)域又可劃分成一個(gè)保守的15kD的多肽結(jié)合功能域和一個(gè)相對(duì)不保守的近C端10kD的可變區(qū)功能域（有研究認(rèn)為它可能與某種特定的蛋白底物相互作用有關(guān)，但結(jié)構(gòu)尚不明確 （陳勁松，2001）），以及位于C端最末端的保守基序（Motif），研究表明不同類(lèi)型的Hsp70成員的保守基序是特異性的，定位于細(xì)胞質(zhì)中的Hsp70的保守基序序列為EEVD，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的保守基序序列為KDEL/HDEL，定位于線粒體中的為PEAEYEEAKK（Guy et aL，1998）。通常藥劑施用量的20%70%可以在土壤中形成結(jié)合殘留，農(nóng)藥殘留物與土壤結(jié)合會(huì)暫時(shí)降低其毒性，但隨著田間的重復(fù)施用，結(jié)合殘留量逐步增加，在一定條件下便會(huì)釋放出來(lái)，由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)。薯塊發(fā)病通常表現(xiàn)為糠心或（和）糠皮。尾端呈圓錐形，通常向腹部彎曲，端圓。關(guān)鍵詞：馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)，熱激蛋白70，殺線蟲(chóng)劑，基因表達(dá)AbstractHeat shock protein 70 kDa (Hsp70s) is the most important proteins among of heat shock proteins，which are widely existsd in cell chamber and organs of both prokaryotes and eukaryotes with a highly conserved sequence．Potato rot stem nematode(Ditylenchus destructor) is one of important pathogens of sweet potato in China, and the enormous yield losses to agriculture is very great annually. After the nematicide application，rudimental nematicide exists mainly in the form of lowdose in soil.In order to understand the effect of low does of nematicides on Hsp70s mRNA expression，three Hsp70 genes，DdHsp70A (GenBank accession No．KF792307)、DdHsp70C (GenBank accession No．JQ422276) and DdHsp70F (GenBank accession No．JQ422277)，were cloned from Ditylenchus destructor using RTPCR and RACE techniques，and the mRNA expression levels of treated by low dose () of abamectin, profenofos and aldicarb were analyzed using Realtime PCR after 24 h．The fulllength cDNA of DdHsp70A was 2081 bp which with anopen reading frame (ORF) of 1938 bp and encoding 645 amino acids residues；the fulllength cDNA of DdHsp70C was 2436 bp with an open reading frame (ORF) of 2019 bp encoding 672 amino acids residues； the fulllength cDNA of DdHsp70F was 2092 bp，which with anopen reading frame (ORF) of 1959 bp encoding 652 amino acids residues．Homology analysis indicated that thosethree genes all contained a highly conserved sequence of Hsp70 family and were highly homologous to Hsp70genes in other nematodes．The structure of DdHsp70A,DdHsp70C and DdHsp70F genomic include 11 extonsand 10 introns，13 extonsand12 introns，11 extonsand 10 introns,respectively．The predicted protein structure showed that the three genes all had ATPase fragment at the Nterminal and developed substrate peptide and Cterminal domains near the Cterminal．After treated by heat shock and low dose emanectinbenzoate，profenofos and aldicarb，the expression levels of DdHsp70A increased significantly pared with control，while DdHsp70C and DdHsp70F showed no significant difference（P）．It is speculated that DdHsp70A is inducible，DdHsp70C and DdHsp70F are constitutive．The results presumed that emamectin benzoate which residues in soil has less effects on D. destructor, aldicarb has more effects on D. results provide useful information for further research mechanisms of nematodes response to low dose of nematicides．Keyword：Ditylenchus destructor，Hsp70s，nematicide，gene expression目 錄第一章 文獻(xiàn)綜述 11 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)研究進(jìn)展 1 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)簡(jiǎn)介 1 傳播途徑及癥狀特點(diǎn) 1 化學(xué)防治 22 熱激蛋白70基因研究進(jìn)展 2 Hsp70的分類(lèi) 3 Hsp70的結(jié)構(gòu)及生化特點(diǎn) 3 脅迫因子 4 Hsp70在生物脅迫生境中的適應(yīng)性作用 43 本研究的目的和意義 5第二章 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)三個(gè)熱激蛋白基因的克隆與序列分析 71 材料和方法 7 供試線蟲(chóng) 7 主要試劑和儀器 7 方法 8 序列分析 212 結(jié)果與分析 21 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)Hsp70基因的克隆 21 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)Hsp70基因的序列分析 25 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析 283 討論 29第三章 不同藥劑處理的馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)Hsp70基因表達(dá)差異分析 311 材料和方法 31 供試線蟲(chóng)及藥劑 31 實(shí)驗(yàn)儀器 31 主要試劑 31 線蟲(chóng)的處理 31 RNA提取及第一鏈cDNA的合成 32 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì) 33 熒光定量PCR 332 結(jié)果與分析 34 熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 34 熱激處理后表達(dá)量分析 35 低劑量殺線蟲(chóng)劑處理后表達(dá)量分析 363 討論 37第四章 不同藥劑處理的馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)生物學(xué)特性分析 391 材料和方法 39 供試線蟲(chóng)及藥劑 39 實(shí)驗(yàn)儀器 39 主要試劑 39 種子催芽 40 根系染色 40 線蟲(chóng)的處理 40 侵染試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 402 結(jié)果與分析 413 討論 44第五章 論文總結(jié) 45參考文獻(xiàn) 47英文縮略表 53致 謝 54作者簡(jiǎn)介 5