【正文】 與雙光口視頻適配器結(jié)合，能夠獲得兩個原始圖像。 減少了光損傷，特別對需要條件溫和的生物體系有利 TIRFM具有高度的界面（表面）特異性，可有效排除本體干擾，獲取界面信息。 The application of the total internal reflection fluorescence microscopy 解依荻 全內(nèi)反射應(yīng)用的核心問題 ?全內(nèi)反射應(yīng)用的核心問題是制作與電子顯微術(shù)（ EM）切片尺寸相當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)切片。 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動力學(xué)、單分子動力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù) 利用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞表面示意圖。 （二）物鏡型全內(nèi)反射顯微鏡 收集樣品熒光信號的接收器 顯微鏡的物鏡 發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件。 基本原理 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 的基本設(shè)計思路 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 的基本原理 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣品 ,從而使樣品表面數(shù)百納米厚的薄層內(nèi)的熒光團受到激發(fā) ,熒光成像的信噪比大大提高。 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展歷程 Hirsch field 完成了 第一個 全內(nèi)反射 熒光實驗 1965年 Axelrod等生物物理 學(xué)家對 TRIFM技術(shù) 及基本原理進行描 述，并探索了其生 物應(yīng)用。 CCD相機的 快速成像 特點提高了其時間分辨率，使得觀察單分子的運動、細(xì)胞物質(zhì)的分泌、蛋白質(zhì)的相互作用成為可能并成為這方面的優(yōu)勢觀察儀器。另一方面它的圖像解釋相對于近場 ,干涉顯微成像來說也較簡單。 ? 目前，已經(jīng)發(fā)展了一種同時可以測電流和熒光信號的實驗系統(tǒng)。與聚焦平面共軛的針孔定位（即共焦）可避免來自檢測器之外的光，即從聚焦平面以外的其它地方反射 /發(fā)射過來的光。 新型的物鏡透鏡、聚光器和其它材料的引入 ? 擁有更寬波長范圍內(nèi)的高透過率 ? 內(nèi)置物鏡采用 UW多層鍍膜技術(shù)，能有效消除超寬譜帶上的反射，在可見光到近紅外光的波長范圍內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)平坦的高透過率，在近紅外和紫外范圍內(nèi)的透過率顯著提高。 。這種物鏡的新特性還包括精選了低自發(fā)熒光玻璃（通過全反射鍍膜和連接材料，顯著減少了自發(fā)熒光），提高了數(shù)值孔徑，增強了信號亮度。 全內(nèi)反射的應(yīng)用比較 ? 共聚焦激光掃描顯微鏡（ CLSM） 和 雙光子激光掃描顯微鏡（ TPLSM） 則是可以檢測細(xì)胞質(zhì)內(nèi)熒光的技術(shù)。 ? 離子通道通過負(fù)責(zé)神經(jīng)，肌肉興奮性細(xì)胞的質(zhì)膜調(diào)節(jié)離子電流和電化學(xué)勢。 ? 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)正是憑借其獨特的優(yōu)勢 (它的熒光激發(fā)深度只在～ 100 nm 的薄層范圍內(nèi) ),從而成為研究 細(xì)胞表面科學(xué) 如生物化學(xué)動力學(xué)、單分子動力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù)。 黃色小圓點 表示被隱失波激發(fā)的熒光分子， 白色小圓點 表示未被激發(fā)的熒光分子。 發(fā)展歷史 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展歷程 近年來人們開發(fā)出了一系列光學(xué)顯微鏡。這種方法的成像裝置簡單，極易和其它成像技術(shù)、探測技術(shù)相結(jié)合，目前已成功的實現(xiàn) 100nm甚至更低的空間分辨率。表達式為： ? NA = nsin（ u/2） ? nsin（ u/2） nsinθc ? NA