廣西地方標(biāo)準(zhǔn)豬藍(lán)耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測(cè)多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見(jiàn)稿(更新版)
【正文】 ，按膠回收試劑盒說(shuō)明書回收、純化PCR產(chǎn)物。_________________________________。挑選陽(yáng)性菌落，増菌培養(yǎng)后，按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒。L；d）cDNA 模板：5 181?！4 連接試劑盒主要成分包括：a）T4 DNA連接酶；b）10T4 DNA 連接酶緩沖液。擴(kuò)增VPRRSV TJMF92株Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下：CAACCCTGCACCTGTGTCATCAAGCAGCTCCCTGTCAAGTGTTAAGATCACACGCCCAACACGCATCCTCGGGAAAATAGGAGACACTGACGAGCTGCTTGACCGGGGTCCCTCGGTACCCTCCAAGGGAGAA PRRSV 特異性探針序列探針序列相關(guān)信息見(jiàn)表?。 若被檢樣品出現(xiàn) HPPRRSV 的特異性擴(kuò)增曲線，且 Ct 值 ≤ 36，判定為 HPPRRSV 陽(yáng)性，記為HPPRRSV（+）；反之，判定為 HPPRRSV 陰性，記為 HPPRRSV（）。用核酸蛋白分析儀測(cè)定其光吸收值( OD260nm )后計(jì)算濃度，用滅菌雙蒸水稀釋至?106 拷貝/μL，作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，20 ℃ 保存?zhèn)溆?。L；i）滅菌雙蒸水：補(bǔ)足總體積至 25 181。L）：各 1181。獲得的 ?cDNA?直接用于?熒光定量 PCR 擴(kuò)增，或置20 ?℃?保存?zhèn)溆?。L；f）隨機(jī)引物?9?聚體（50?pmol/181。L。否則，應(yīng)在使用前經(jīng) DEPC水處理，然后用 10 5 Pa 高壓滅菌 30 min。上、下游引物及探針的使用濃度均為?25?pmol/181?！∝i繁殖與呼吸綜合征病毒野毒株 wildtype porcine reproductive and respiratory syndrome virus，WPRRSV指在臨床上分離的具有致病性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲基因型經(jīng)典株或變異株。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局提出并歸口?！∝i繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型變異株 highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HPPRRSV指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位氨基酸和第 533?561 位氨基酸出現(xiàn) 30 個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失為特征的、以 JXA1毒株為代表的高致病性美洲基因型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。3 材料準(zhǔn)備 試劑 特異性引物及探針引物和探針序列見(jiàn)附錄?A?中的表 。注：離心管、PCR 反應(yīng)管、吸頭、熒光PCR反應(yīng)管等應(yīng)使用無(wú) RNA 酶的一次性塑料制品?！》崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為?10 ?181。L；e）MgCl 2溶液（25 mM/L）：2?181。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ?℃，10 min；42 ?℃，30 min；95 ?℃，5 min。L；d）TJMPRRSVF,TJMPRRSVR 引物（25 pmol/181。L；h）反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA：2 181?；蛘?，使用CPRRSV pCNsp2 質(zhì)粒、HPPRRSV pVNsp2 質(zhì)粒及VPRRSV pTJMNsp2質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。DB45/T XXXXX—XXXX5 結(jié)果判定 若被檢樣品出現(xiàn) CPRRSV 的特異性擴(kuò)增曲線，且 Ct 值 ≤ 36，判定為 CPRRSV 陽(yáng)性，記為 CPRRSV（+）；反之，判定為 CPRRSV 陰性，記為 CPRRSV（）。擴(kuò)增HPPRRSV代表毒株JXA1株（GenBank 登錄號(hào)：EF112445）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下：GAGTGGGTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGACGCACCAGGATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGC 擴(kuò)增的VPRRSV Nsp2基因目的片段擴(kuò)增VPRRSV Nsp2基因中133 bp 的片段。 膠回收試劑盒主要成分包括：a）GM緩沖液；b）WB緩沖液；c）洗脫緩沖液；d）離心柱；e）收集管。L；c）上、下游引物（25 pmol/μL）：各 1 181。按T4連接酶試劑盒說(shuō)明書將PCR產(chǎn)物連接到pMD18T載體，然后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/Amp+/Xgal/IPTG平板上37
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