廣西地方標準豬藍耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見稿(存儲版)
【正文】 ....................................3 操作環(huán)境 ........................................................................3 待檢樣品處理 ....................................................................3 待檢樣品總 RNA 提取 ..............................................................3 反轉(zhuǎn)錄 ..........................................................................3 多重?zé)晒舛?PCR ................................................................3 陽性對照及陰性對照 ..............................................................45 結(jié)果判定 ............................................................................4 結(jié)果分析條件設(shè)定 ................................................................4 質(zhì)控標準 ........................................................................4 結(jié)果判定 ........................................................................4附錄 A（規(guī)范性附錄） 引物、探針序列及結(jié)果判定 .........................................5附錄 B（規(guī)范性附錄） 試劑盒 ...........................................................7附錄 C（規(guī)范性附錄） 重組質(zhì)粒標準品制備 ...............................................9DB45/T XXXXX—XXXXII前? ? 言本標準按照?GB?/?T ?給出的規(guī)則起草。2 術(shù)語和定義DB45/T 10102022所定義的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件?！【酆厦告湻磻?yīng) polymerase chain reaction，PCR是一種由熱變性→復(fù)性→延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，經(jīng)多次循環(huán)反應(yīng)，在體外快速擴增特定脫氧核糖核酸（DNA）片段的方法?！晒舛?PCR 試劑盒商業(yè)化的熒光定量 PCR 試劑盒主要成分見附錄?B 中的 ，使用前經(jīng)技術(shù)驗證合格。血清樣品可直接用于總 RNA 抽提，或置 20 ℃ 保存?zhèn)溆?。L；c）dNTP?混合物（各?10?mM/L）：1?181。L。L；b）ROX 參比染料 II： 181。L）： 181。注：某些商業(yè)公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀需加入ROX參比染料?！≠|(zhì)控標準 陰性對照樣品 Ct 值36。表 引物序列及擴增長度引物名稱 引物序列（5′→3′） 針對毒株 長度（bp）NAPRRSVF GAGTGGGTCGGCTCCAGTTCNAPRRSVR GCCTCATATTCCGTCTGTGA CPRRSV/HPPRRSV195 或 108TJMPRRSVF CAACCCTGCACCTGTGTCATTJMPRRSVR TTCTCCCTTGGAGGGTGCC VPRRSV 133注：NAPRRSVF 和 NAPRRSVR 引物對擴增 CPRRSV 時長度為 195 bp，擴增 HPPRRSV 時長度為 108 bp；TJMPRRSVF和 TJMPRRSVR 引物對擴增 VPRRSV 時長度為 133 bp?！∩虡I(yè)化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒主要成分包括：a）10?RT?緩沖液；b）AMV 反轉(zhuǎn)錄酶；c）dNTP?混合物：包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；d）RNA?酶抑制劑；e）氯化鎂（MgCl 2）溶液；f）隨機引物?9?聚體。以獲得的cDNA為模板，分別利用NAPRRSVF/NAPRRSVR、TJM
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