質(zhì)粒dna制備(更新版)
【正文】 不提倡選擇煮沸法 ， 這類細菌富含糖類 ， 在煮沸或去污劑裂解細菌時 ， 大量釋放出來 。 ? 細胞的裂解方法很多 ， 如去污劑法 ， 沸水熱裂法 、 堿變性法 ， 有機溶劑法和溶菌酶法等 。 ? 對于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上受到宿主細胞的控制，故在細菌對數(shù)生長后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體 DNA的復(fù)制。 ? 若 lacZ基因被外源 DNA片斷插入而破壞，則不能制造半乳糖苷酶，菌落為白斑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 30多個這樣的不相容組。這類質(zhì)粒在宿主細胞蛋白質(zhì)停止合成 (加入氯霉素 )、染色體 DNA停止復(fù)制的條件下，拷貝數(shù)繼續(xù)增加至數(shù)千。 ? 確切地說 ， 質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子 ， 它能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞表型 ， 是比病毒更簡單的原始生命 。 ? 1952年 ， 由 Lederburg正式命名為質(zhì)粒 。 ? 有些質(zhì)粒則處于 “ 松弛控制 ” ，每個細胞可含達 1520乃至數(shù)百拷貝的質(zhì)粒。帶有相同復(fù)制子的質(zhì)粒屬于同一不相容組，而帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于不同的不相容組。 ? 半乳糖苷酶 ? Xgal X + gal ? 無色 藍色產(chǎn)物 半乳糖 ? ? 若在含有 Xgal的培養(yǎng)劑中，在乳糖操縱子 (lac operon)誘導(dǎo)物異丙硫半乳糖苷(isopropylthiogalactoside， IPTG)的作用下，細菌合成半乳糖苷酶，分解 X— gal，此菌落成為藍色。 四、質(zhì)粒 DNA的提取和純化 （一）、 質(zhì)粒提取的主要步驟 1．細菌的培養(yǎng)： ? 先分離單個菌落， 接種到含少量適當抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質(zhì)粒 DNA也在自主復(fù)制。 2．細菌的收集與裂解 ? 細胞生長過程中 ， 排出大量代謝產(chǎn)物 ，為了提高質(zhì)粒 DNA的純度 ， 離心棄上清 ，細菌沉淀最好用 STE或生理鹽水懸浮 ，漂洗 l2次 ， 離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細去除干凈 。 ? 對于 DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標記等實驗，直接用小量或中量提取的 DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實驗要求。 3．細菌染色體 DNA變性條件強弱的控制 ? 堿法是目前實驗室中最常用的質(zhì)粒DNA提取方法 。 ? 將 pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下 ， 染色體 DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 。
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