【正文】 ，在藥物處理 2~4h后被檢測(cè)出來（圖 2， C和 D）中，隨后在 4~6h caspase3被激活（圖 2， E和F），在處理 8小時(shí)后，細(xì)胞凋亡通過膜聯(lián)蛋白 V染色表現(xiàn)，（圖 2， E和 F）。人類 TR1，其中有一個(gè) C末端的活性位點(diǎn)硒代半胱氨酸殘基，被認(rèn)為是 IQs的潛在目標(biāo)。檢測(cè) Western印跡信號(hào)用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光 Western印跡檢測(cè)試劑 （通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，查爾方特圣吉爾斯，白金漢郡，英國(guó)）。 （ 1951）。在另一個(gè)管中的細(xì)胞沉淀物溶解于 120 微升的 5％三氯乙酸，立即渦旋 10秒，然后以 5000rpm離心 10分鐘以沉淀細(xì)胞蛋白。 GSH/ GSSG系數(shù) 的測(cè)定 在解凍前將冷凍細(xì)胞沉淀物（ 2 10^6）之前在 150微 L冰冷的 ，以防止在制備過程中人為形成巰基二硫化物。 谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性測(cè)定 1） 在細(xì)胞中谷胱甘肽 還原酶（ GR）的活性測(cè)定使用先前描述的方法（ Gromer等人，1998）。掃描光譜范圍為全掃描，設(shè)置為 400~2022。 5） 變性的蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基，然后通過二硫蘇糖醇還原其次是碘乙酰胺烷基化被修飾。 2） mol重組大鼠 TR1， 250微 mol的 NADPH， 2微 mol的 NQ02，和 200微 mol的 NRH的混合物在上述緩沖液中孵育，在室溫溫度下保持 5分鐘。芐氧羰基 DEVD氨基 4 甲基香豆素。 6）光密度在使用 Thermomax酶標(biāo)儀 550nm波長(zhǎng)測(cè)定 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). 7） IC 50值被定義為 IQ 的濃度 —— 與對(duì)照組相比，導(dǎo)致降低了 50％的細(xì)胞數(shù)的濃度。 1） MIA PACA2人胰腺癌癌細(xì)胞從 American Type Culture Collection (Manassas, VA)獲得。這些結(jié)果描述了在人胰腺癌細(xì)胞中的氧化還原和與 IQs毒性機(jī)制相關(guān)的信號(hào)通路。 Grippo et al., 1983。在 NCL60腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)中，兩類分子都表現(xiàn)出一種細(xì)胞毒性的模式，這表明，對(duì)結(jié)腸癌，腎癌和黑色素瘤細(xì)胞系，兩類分子都有優(yōu)先的毒性模式 (Yan et al., 2022)。使用液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法分析發(fā)現(xiàn)， TR1的 C末端硒代半胱氨酸被認(rèn)為是 IQ衍生出來的活性亞胺的主要內(nèi)收位點(diǎn)。 TR1通過 IQs而被抑制的機(jī)制在無細(xì)胞體系中用純化的酶做具體的研究。 (Yan et al., 2022)。 (Cromlish and Roeder 1989。在無細(xì)胞和細(xì)胞系統(tǒng)中，這些 IQs都抑制了 TR1，導(dǎo)致通路級(jí)聯(lián)的活化，包括 ASK1和 P38/JNK MAPKS的信號(hào)通路。 11） 除非指明，所有其它化學(xué)品購自 SigmaAldrich公司 細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染。 5）細(xì)胞存活率通過測(cè)量來確定 MTT還原成結(jié)晶甲臜的產(chǎn)物，加入 100微升 DMSO講產(chǎn)物溶解。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞收集到的裂解緩沖液和超聲處理，細(xì)胞裂解物 中的胱天蛋白酶 3活性用熒光測(cè)定通過以下所述基板的切割所測(cè)量 209。 無細(xì)胞體系 TR1的抑制作用 1） 抑制反應(yīng)進(jìn) 行在 100mM磷酸鉀緩沖液， ，含有 2mM EDTA和 1毫克 /毫升的牛血清白蛋白。 3） 加入 1微升的溶解在 DMSO的 4mM IQs，混合物再孵育 30分鐘 4） 將反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)在 6微 M鹽酸胍，在 70℃下進(jìn)行 30分鐘。 11） 16分鐘從 3%至 80％溶劑 B（ A， ％甲酸： B， 90％乙腈 / ％甲酸） 使用在 350升 /分鐘，在 3％的 B的第一分鐘，隨后通過線性增加至 40％ B，在 9分鐘，最后保持在 80％ B 3 min . 12）光譜用 Waters四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀以正模式記錄。 TR1的活性表示為 DMSO處理的對(duì)照的百分比。然后，加入基板叔丁基過氧化氫（終濃度 1 毫摩爾）到溶液，在 340nm處測(cè)定 NADPH的消耗。 （ 1951）。 BioRad實(shí)驗(yàn)室，赫拉克勒斯， CA），蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定使用 Lowry等人的方法。然后將膜與探測(cè)對(duì)磷酸化 p38（ Thr180/ Tyr182），磷酸化的初級(jí)抗體 JNK（ Thr183/ Try185），磷酸 ASK1（ Ser83），和β肌動(dòng)蛋白的抗體，二抗為通過辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 /兔免疫球蛋白（杰克遜免疫研究實(shí)驗(yàn)室，西樹叢， PA）。 IQs的作用機(jī)制圖示于圖 1B，包括 IQs的氧化還原，排出的離去基團(tuán)，親電子的產(chǎn)生的烷基化物種（圖 1B）。在目 前的研究中，我們證實(shí)了 MIA PACA2細(xì)胞凋亡上劑量依賴性的增加，無論是被 IQ1或 2的處理 18h后，在濃度范圍大致相對(duì)于 MTT的 IC 50值 （圖 2， A和 B）。 TR1的抑制似乎是不可逆的，因?yàn)?TR1的酶的使用 Millipore公司的分子截留設(shè)備脫鹽后并沒有導(dǎo)致恢復(fù)酶的活性（數(shù)據(jù)未顯示）。 TR1活性是使用端點(diǎn)胰島素還原活性的測(cè)定的。 GR有類似與 TR1的蛋白結(jié)構(gòu)，但是缺乏缺乏 C末端硒代半胱氨酸殘基（ Sandalova等人， 2022）。dichlorofluorescein二乙酸酯，并沒有增加 可檢測(cè) 到熒光（數(shù)據(jù)未顯示）。如該圖所