【正文】 進(jìn)行分類鑒定。 由于引起感染所需的 O157: H7劑量很低 ,有必要發(fā)展一些靈敏度高的方法 ,用于快速有效地檢測 。 如發(fā)酵山梨醇的變異株用 SMAC即不能檢測到 。 ? 應(yīng)用： ? 檢測臨床感染性疾病的病原菌 首先，將兩條引物設(shè)計(jì)在保守區(qū)，成為通用引物，而在變異區(qū)中選擇序列作為特異性探針，先用通用引物作 PCR擴(kuò)增，可篩選出含有病原菌的樣本，再用特異性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，對(duì)目的細(xì)菌作出鑒定，達(dá)到診斷病原體及分型的目的。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，微生物檢測進(jìn)入了基因時(shí)代，以核糖體核糖核酸序列為基礎(chǔ)的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學(xué)方法。 Meng等同時(shí)擴(kuò)增了 eae 上游基因片段 、 sitⅠ 基因片段 、 sit Ⅱ 基因片段 ,其長度分別為 63 2 484bp。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析、核酸序列分析。 如用 TaqDNA聚合酶 ， 一般取 7075 ℃ ， 常用 72 ℃ 。 對(duì) GC含量高的靶 DNA序列 ， 宜用較高的變性溫度 。 ? 模板 DNA： 應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合 DNA的蛋白酶。 Huck等篩選了 O157: H7大質(zhì)粒上限制性片段 ,發(fā)展了一種 Sma I片段探針 ,認(rèn)為此探針對(duì) O157: H7血清型最為特異 ,可與所有 O157: H7試驗(yàn)菌雜交 。 1． DNA探針 ? 探針 (probe)標(biāo)記：放射性核素 、 非放射性物質(zhì)標(biāo)記 。 ? 特點(diǎn)是具有比較高的特異性和敏感性 。 Morooka等檢測了 溶血性尿毒綜合征 (HUS)病人血清 LPS抗體 ,雖然甲醛化羊紅細(xì)胞 (SRBC)有低水平非特異性吸附 ,但不影響該方法作為一種有效 、 快速 （ 3h） 的診斷方法 。但由于熒光染料的非特異染色 ,不但被檢菌被染色 ,本底雜菌也可染色 ,從而影響了結(jié)果的精確性。 總特異性為 %。 金顆粒的大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量 。 二．血清學(xué)檢測 1．玻片凝集試驗(yàn) 2. 膠體金免疫技術(shù) 3. ELISA 4．免疫熒光技術(shù) 5． 膠乳凝集 6. 間接血凝分析 (IEHA) 7. 全自動(dòng)抗原抗體檢測系統(tǒng) 8. 免疫印記法 1．玻片凝集試驗(yàn) ? 玻片凝集試驗(yàn)是鑒定 O抗原最經(jīng)典的方法 ,實(shí)驗(yàn)中如果凝集反應(yīng)不明確，但根據(jù)臨床表現(xiàn)和生化反應(yīng)等菌株高度可疑時(shí) ,可 100℃ 加熱菌液30min再行玻片凝集試驗(yàn)。用無關(guān)的抗體包被磁 ,則大腸桿菌 O157: H7不結(jié)合。 ? 目前，污染的肉、家畜，甚至飲用水均面臨大腸桿菌 O157: H7的衛(wèi)生威脅。 ? Chapman等 共檢測大便標(biāo)本 690份 , 免疫磁珠分離法檢出 25 。 ? 方法 : 。病死率一般在 10%，各別可高達(dá) 50%。 大腸桿菌 O157: H7傳染源和傳播途經(jīng) ? 大腸桿菌 O157: H7基本上是一種食源性病原菌，可通過食用 大腸桿菌 O157: H7污染的 牛肉、牛奶、牛肉或制品、雞肉、蔬菜、水果、飲料、水等感染 ,也可通過人與人、人與動(dòng)物密切接觸傳播。架上 。 ? Chapman等先用 EC肉湯增菌 ,然后用免疫磁珠分離法富集牛糞便大腸桿菌 O157: H7菌株 ,再用選擇性培養(yǎng)基分離 ， 并與 CRSMAC和 CTMAC直接培養(yǎng)作比較 。結(jié)果顯示 ,在原緩沖液檢出大腸腸菌的范固為 100－ 1000 cfu/lm,在食品檢出的范圍為 1000－ 2020cfu/lm ， 檢測時(shí)間十分快 ,一般不到 1小時(shí)。 因此用生化試驗(yàn)確定為大腸桿菌是必須的 。鑒定 H抗原也應(yīng)同時(shí)做玻片和試管凝集試驗(yàn) ,并應(yīng)先對(duì)待檢菌做動(dòng)力試驗(yàn) ,在動(dòng)力活潑時(shí)取培養(yǎng)物做 H抗原鑒定。顯色程度與樣品中細(xì)菌含量成正比，最低測菌量為少于 100個(gè)菌細(xì)胞，主要特點(diǎn)是敏感性高，可用于待檢樣品初篩，陽性樣品可進(jìn)行細(xì)菌分離，減少工作量。 單克隆抗體用于檢測大腸桿菌O157: H7有明顯特異性 ， 可作為一種免疫試劑用于臨床和食物標(biāo)本的快速檢測 。 Czajlu等用熱殺死的 O157: H7菌包被玻璃毛細(xì)管作固形支持物。 可直接從感染性疾病患者標(biāo)本中檢測細(xì)菌 、 病毒 、弓形蟲 、 衣原體和螺旋體等微生物的抗原 、 抗體或毒素 。 二．分子生物學(xué)檢測 分子生物學(xué)的出現(xiàn)，為更快診斷微生物提供了許多分子學(xué)工具。 ? 雜交方法：斑點(diǎn)雜交 、 southern印跡 、 原位雜交 、 Northern印跡 等 。 PCR技術(shù)擴(kuò)增體系的基本成分 ? 引物 : PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。 ? 緩沖液及其他成份： PCR反應(yīng)體系中，一般采用 TrisHCl緩沖液。 原則上變性步驟應(yīng)高溫 、 短時(shí) ， 即要保證變性充分 ， 又要保持聚合酶在整個(gè)反應(yīng)中的活性 。 對(duì)于擴(kuò)增 100— 300個(gè)堿基的短序列片段 ， 可省去延伸溫度這一步驟 ， 而采用快速簡便的變性 、 退火雙溫循環(huán) 。 ? Thomas等用 PCR擴(kuò)增了 slt基因片段 。 嚴(yán)笠選用針對(duì)大腸桿菌 O157: H7志賀樣毒素 Ⅰ 、 Ⅱ （ SLT－ Ⅰ 、SLT－ Ⅱ ） 和溶血素 （ Hly） 基因的三對(duì)引物 ,在同一擴(kuò)增體系中進(jìn)行 PCR,檢測 12株不同來源的 O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌 、 志賀菌 15株 。目前已知 23SrRNA基因全長序列的菌種數(shù)目已達(dá) 250種。為流行病提供依據(jù)。