【正文】 似性和 %的 DNADNA 雜交率。 The optimum temperature for growth is 37 ℃ . The pH range for growth is , with an optimum pH . Growth occurs in the presence of 03 % (w/v) NaCl. Optimum NaCl1%. KBL49 nearest relative of the strain Pseudomonas xinjiangensis S33T with %, 16S rRNA gene sequence similarity, % DNA–DNA relatedness. The G+C content of the genomic DNA was %. The major fatty acids were C16:0, Summed Feature 8, C17:0 cyclo, C19:0 cyclo w8c, C12:0, Summed Feature 3, C12:0 3OH and C10:0 3OH. The predominant isoprenoid quinone was Q10. On the basis of phenotypic properties and phylogeic inference, strain KBL49T represents a novel species of the genus Pseudomonas, for which the name Pseudomonas Tograkense is proposed. The type strain is KBL49T. Key words: ancient Kiyik river。 胡楊對(duì)極端環(huán)境有很強(qiáng)的抗逆性，在干旱沙漠地區(qū)唯一能生存的喬木，有 “ 生而一千年不死，死而一千年不倒，倒而一千年不朽 ” 的強(qiáng)大生命力。 Kiyik 河道是塔河中游的廢棄 343 年的廢棄古河道， 由于 Kiyik 河和新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 10 尉犁縣卡爾區(qū)尕鄉(xiāng)之間分布著直線(xiàn)距離 29Km以上的沙丘荒漠（沒(méi)有行車(chē)的道路），斷流年代比較久遠(yuǎn)，脫離了塔河水系，因此分布在 Kiyik 河流域的胡楊林形成了在時(shí)間和空間上相對(duì)隔離封閉的生態(tài)體系。 內(nèi)生菌與宿主植物的關(guān)系 地球上有約 30萬(wàn)種植物，它們分布的環(huán)境各也各有差異，這些多種多樣的植物為微生物提供了多元化的、極為復(fù)雜多樣的棲息地。 植物內(nèi)生菌多樣性研究進(jìn)展 自 20世紀(jì) 30年代發(fā)現(xiàn)造成畜牧業(yè)重大損失的牲畜中毒是由于食用感染內(nèi)生菌的牧草后，內(nèi)生菌的研究才得以廣泛地開(kāi)展起來(lái) [15]。 Rodrigo Mendes, Aline A, PizziraniKleiner 等人從甘蔗的根際，根內(nèi)和莖部取樣而分離了154株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌并鑒定 16S rDNA序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的分離菌株隸屬于 4個(gè)屬，其中伯克霍德菌屬（ Burkholderia）占優(yōu)勢(shì) [18]。該方法直 觀(guān)快捷，而且可以提供具有代謝活性、異養(yǎng)類(lèi)型等種群信息。 3) 生物標(biāo)記法 生物標(biāo)記法主要是利用微生物細(xì)胞內(nèi)某種生化成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)區(qū)別微生物種類(lèi)。該方法的步驟主要包括土壤 DNA 的提取克隆文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 。 生理特征是指，細(xì)菌在 固定條件下生長(zhǎng)能力。 DNA 堿基組分分析 染色體 DNA 的 G+C 含量也就是 DNA 的四種堿基 G、 C、 A、 T 的組成具有特異性且不受菌齡和外界因素的影響，是細(xì)菌多相分類(lèi)中的重要指標(biāo)。為植物內(nèi)生菌增加了 10 個(gè)屬 18 個(gè)種。 42′ 8″ E 85176。 試驗(yàn)儀器 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司的 SWCJIF 生物超凈工作臺(tái)、上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠(chǎng)的 PYXDHS5065 恒溫培養(yǎng)箱、德國(guó)基因公司的 Eppendorf Mastercycler PCR 儀、美國(guó) OLYMPUS 公司的 CX21FS1 OLYMPUS 顯微鏡、北京六一儀器廠(chǎng)的 DYYIII3A 水平電泳槽、 sigma 公司小型超速低溫離心機(jī)、美國(guó) Alphaimage公司的 Alphaimage2200TM 凝膠成像儀 。 4) 載玻片上滴加結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位靜止 1min 即可。 5) 用番紅染液 23min，水洗，干燥。 6) 上清加 200μl酚 /氯仿 /異戊醇（ 25:24:1），顛倒（ 4 到 5 次）混勻。 表 2 擴(kuò)增 16S rRNA 基因片段的 PCR 體系及程序 系統(tǒng)發(fā)育 分析 PCR 產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序 16S rRNA 基因序列。 2) 將紙放入凍干管中，用牙簽卷著棉花塞凍干管口，每一種菌的兩個(gè)管用橡皮筋纏一起。 10) 將凍干管先放入 4℃冰箱中 30 分鐘，迅速轉(zhuǎn)移到 20℃冰箱中一個(gè)小時(shí)，再放入 70℃， 34 小時(shí)，在迅速轉(zhuǎn)移到凍干機(jī)上凍干（看到牛奶裂縫透明說(shuō)明已干）。共 80 株細(xì)菌中 25 株是從 LB 培養(yǎng)基， 18 株是從 MA 培養(yǎng)基， 16 株是從 KB 培養(yǎng)基，而 22 株是從 NB培養(yǎng)基上分離得到的。 19′ 09″）的三個(gè)采樣點(diǎn) 胡楊莖稈液樣品中用四種培養(yǎng)基（ LB， NB， KB， MA）分離并鑒定出了屬于 16 個(gè)屬，24 個(gè)種的 80 株細(xì)菌 。 80 株細(xì)菌的具體 16Sr RNA 基因序列相關(guān)菌株以及相似率見(jiàn)表 4。 除了這三個(gè)優(yōu)勢(shì)屬之外 還分離到了出現(xiàn)頻率較低的其他 13 個(gè)屬。 23′ 22″），（ N40176。這些細(xì)菌有白色，奶油色，黃色，紅色，粉色和透明等菌落顏色。 6) 每一個(gè)菌種取兩個(gè)斜面進(jìn)行凍干，若菌量太少可以取四個(gè)斜面。 N 為每種培養(yǎng)基分離的細(xì)菌種類(lèi)數(shù)量， NT 為分離細(xì)菌的全部種類(lèi)數(shù)量。 煮沸法 [38]（方法二）： 1) 菌株在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用接種環(huán)刮取適量菌體置 離心管。 2) 加 1000ml預(yù)冷丙酮， 8000rpm離心 2min。 革蘭氏染色 [36] 1) 用接種環(huán)挑取少許細(xì)菌，涂布在載玻片上的一滴生理鹽水中，干燥。 細(xì)菌的純化 選擇出在菌落顏色、形狀、邊緣、隆起狀況等特性上有差異的菌株，使用平板劃線(xiàn)法獲得純培養(yǎng)物。43′ 19″ E 85176。 本研究的意義在于：（ 1）由于受到的人類(lèi)影響少，期待從原始環(huán)境中發(fā)現(xiàn)中國(guó)新記錄種和潛在的國(guó)際新種；（ 2）對(duì)于所鑒定的細(xì)菌進(jìn)行篩選，選擇對(duì)于我們生產(chǎn)生活具有重要意義的產(chǎn)物進(jìn)行研究。 化學(xué)特征分析法 化學(xué)分類(lèi)是指研究微生物細(xì)胞不同化學(xué)特性，并利用這些特殊性對(duì)生物個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)鑒定。對(duì)同等條件下培養(yǎng)的細(xì)胞可溶性蛋白進(jìn)行 SDSPAGE 電泳分析，可以得到反映生物基因組成的蛋白質(zhì)圖譜信息，進(jìn)而分析獲得菌株蛋白質(zhì)圖譜的多樣性特征。 形態(tài)學(xué)特征 形態(tài)學(xué)特征易于觀(guān)察和比較，尤其是在具有圖書(shū)形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌中；再說(shuō)，許多形態(tài)學(xué)特征依賴(lài)于多基因的表達(dá)，具有相對(duì)的穩(wěn)定性；最后根據(jù)形態(tài)學(xué)特征分類(lèi)方法簡(jiǎn)單、快速、價(jià)廉。 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù) 1) 熒光原位雜交技術(shù) ( FISH) 利用探針可以直接和環(huán)境土壤樣品、純培養(yǎng)菌落進(jìn)行原位雜交，獲得自然和人工狀態(tài)下微生物種類(lèi)、相對(duì)豐度和空間分布信息 。 Garlan 和 Mills[25]于 1991 年首次提出該技術(shù)，經(jīng) BIOLOG 公司商業(yè)化后在土壤 微生物群落功能多樣性的評(píng)價(jià)研究中得到了廣泛的應(yīng)用 [26]。首都師范大學(xué)生科院的 Lei Sun, Fubin Qiu等人把河北省農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站的水稻作為樣品分離了可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，克隆 192株菌株的 16S rDNA基因，并 鑒定了 52個(gè)分類(lèi)單元的基因序列 [22]。目前研究的關(guān)于微生態(tài)的植物已達(dá)上百種 [16]。也有研究中發(fā)現(xiàn)，寄主種的水平上有專(zhuān)一性的一些內(nèi)新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 11 生真菌。 1986年Carroll[6] 將 內(nèi)生菌 定義為：是 生活在活的植物組織內(nèi)而對(duì)植物不引起明顯病害癥狀的真菌，強(qiáng)調(diào) 了 內(nèi)生菌與植物的互惠共生的關(guān)系。新疆分布著目前全世界上最大的天然胡楊林。 16S rRNA。 關(guān)鍵詞： Kiyik 古河道；胡楊；內(nèi)生細(xì)菌；多樣性； 16S rRNA； 多相分類(lèi)學(xué) 新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 5 Abstract The aim of this study was to identify the culturable endophytic bacteria isolated from storage liquid of six Populus Euphratica stands at the ancient Kiyik River which dried up 343years before. Through conventional dilutionplating method, we isolated 80 pure cultivable strains. Among them, 25 strains were isolated on LB plates, 21 were isolated on NB plates, 16 were isolated on KB plates and 18 strains were isolated on MA plates. Gram staining and simple staining test results of the isolates shows that 17 strains were grampositive, 63 strains were gramnegative, and 3 strains were coccus, 32 strains were rodshaped and 45 strains were short rodshaped. The phenotypic properties, biophysical characterization, 16S rRNA gene sequence analysis and phylogeic analyses showed that 80 strains could be placed into five phylogeic groups (γProteobacteria, αproteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes), 16 genera, and 24 species. Amomg them, 49 isolates belong to γProteobacteria, occupy % (49/80) of total isolates。 在 80 株細(xì)菌當(dāng)中發(fā)現(xiàn) 與 Pseudomonas xinjiangensis 、 Pseudomonas sabulinigri 、 Pseudomonas azotifigens 、 Pseudomonas pelagia 、 Rhizobium rosettiformans、 Microbacterium hydrocarbonoxydans、 Microbacterium sedminis 、Halomonas sulfidaeris、 Halomonas meridiana、 Halomonas desiderata、 Nesterenkonia aethiopica、 Nesterenkonia suensis 、 Nocardioides alkalitolerans、 Planococcus maritimus、 Pontibacter salisaro、 Planomicrobium koreense 和 Pantoea brenneri 等模式菌株 有著低于 %的 16S RNA 基因 序列相似性 的 59 株細(xì)菌。 阿木提 學(xué) 科 專(zhuān) 業(yè)： 生 物 學(xué) 研 究 方 向： 微生物學(xué) 導(dǎo)師 姓名 職稱(chēng)：艾爾肯 表型 特征 和 16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果 顯示 ， 80 株菌歸類(lèi)為 厚壁菌門(mén) （ Firmicutes ） 、 放線(xiàn)菌門(mén)（ Actinobacteria ）、 α 變 形 菌 綱 （ Alphaproteobacteria ）、 γ 變 形 菌 綱（ Gammaproteobacteria） 和擬桿菌門(mén) （ Bacteroidetes） 等 5 個(gè)類(lèi)群 ， 16 個(gè)屬， 24個(gè)種 。 基因組 DNA 的 G+Cmol%含量是 %。 Populus Euphratica。胡楊繁殖力高，生長(zhǎng)慢、抗逆性強(qiáng)，對(duì)于改善生態(tài)環(huán)境，遏制沙漠化，保護(hù)生物多樣性等諸多方面具有重要作用，是下游綠色走廊的一道生態(tài)屏障 [3]。與塔河主河道相比 kiyik 河胡楊的長(zhǎng)勢(shì)較彎曲莖部分支多，表皮更粗糙，明顯表達(dá)出了胡楊適應(yīng)惡劣環(huán)境的形態(tài)特征。 內(nèi)生菌可以提高宿主植物的一些機(jī)制，包括形成的根外菌絲營(yíng)養(yǎng)吸收，刺激根系生長(zhǎng)，促進(jìn)植物的新陳代謝，促進(jìn)氮，磷的吸收，固氮，可以改善土壤或根系分泌物 [10]。植物內(nèi)生菌幾乎存在于所有目前已研究過(guò)的植物中，分布廣，種類(lèi)多。 Pious Thomas .Ganiga K. Swarna等人通過(guò) 16S rDNA序列鑒定分離于香蕉莖尖培養(yǎng)物的可培養(yǎng)和免培養(yǎng)內(nèi)新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 12 生細(xì)菌，這些細(xì)菌隸屬于 5個(gè)