【正文】 ..................................................... 34 響應面優(yōu)化 ................................................................................... 36 結(jié)論與討論 ............................................................................................. 39 第五章 菌株 LM2303 抑菌作用研究 ................................................................. 41 材料 ......................................................................................................... 41 微生物菌株 ................................................................................... 41 試劑 ............................................................................................... 41 儀器 ............................................................................................... 42 培養(yǎng)基 ........................................................................................... 42 方法 ......................................................................................................... 43 菌懸液制備 ................................................................................... 43 菌株 LM2303 對有害微生物生長的影響 ................................... 43 抑菌物質(zhì)粗提物制備 ................................................................... 43 抑菌物質(zhì)抑菌譜測 定 ................................................................... 44 真菌孢子懸液制備 ....................................................................... 44 抑菌物質(zhì)對真菌孢子萌發(fā)的影響 ............................................... 44 抑菌物質(zhì)對真菌菌絲形態(tài)的影響 ............................................... 44 抑菌 物質(zhì)穩(wěn)定性研究 ................................................................... 45 III 抑菌物質(zhì)分離純化及定性研究 ................................................... 45 結(jié)果與分析 ............................................................................................. 47 菌株 LM2303 對有害微生物的抑制作用 ................................... 47 菌株 LM2303 抑菌物質(zhì)抑菌譜 ................................................... 48 對真菌菌絲形態(tài)的影響 ............................................................... 49 對真菌孢子萌發(fā)的抑制作用 ....................................................... 50 抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性研究結(jié)果 ....................................................... 51 抑菌物質(zhì) 分離純化及鑒定 ........................................................... 52 結(jié)論與討論 ............................................................................................. 55 第六章 生防菌株在冬棗貯藏中的應用 ............................................................. 56 材料 ......................................................................................................... 56 菌株 ............................................................................................... 56 培養(yǎng)基 ........................................................................................... 56 試劑 ............................................................................................... 57 儀器 ............................................................................................... 57 方法 ......................................................................................................... 57 冬棗貯藏期致腐真菌的分離 ....................................................... 57 回接驗證試驗 ............................................................................... 58 冬棗致腐真菌的種屬鑒定 ........................................................... 58 冬棗致腐真菌 拮抗菌株的篩選 ................................................... 58 結(jié)果與分析 ............................................................................................. 58 冬棗致腐真菌的分離鑒定 ........................................................... 58 冬棗致腐真菌拮抗菌株的篩選結(jié)果 ........................................... 60 結(jié)論與討 論 ............................................................................................. 61 第七章 結(jié) 論 ..................................................................................................... 62 參考文獻 ............................................................................................................... 63 致 謝 ................................................................................................................... 70 作者簡介 ............................................................................................................... 71 IV 廣譜高效微生物防腐劑產(chǎn)生菌的篩選及應用 1 第一章 前言 研究背景 在食品工業(yè)中，糧食、果蔬及加工類食品的防腐保鮮始終是一個亟待解決的重要問題，據(jù) FDA 統(tǒng)計，全世界每年約有 10% ~ 20% 的食物損失于各種腐敗，其中微生物侵染是導致食物腐敗變質(zhì)的主要因素。 由于物理和化學方法在實際生產(chǎn)應用中存在一定局限性，迫切需要尋求更安全有效的防腐保鮮新技術(shù)。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，生防微生物菌株對有害微生物的作用方式主要有拮抗作用、寄生作用、競爭作用和誘導抗性等。王亮等的研究表明梅奇酵母 XY201在冬棗表皮具有很強的定殖能力，在人工氣調(diào)條件下貯藏，梅奇酵母 XY201 能有效抑制冬棗黑斑病的發(fā)生，使發(fā)病率降低 %%(王亮等 , 20xx)。楊震等的研究結(jié)果表明采用 1108 CFU/mL 的枯草芽孢桿菌 BS331 菌懸液浸泡油桃可達到與納他霉素 (300 mg/L)相當?shù)姆乐斡吞也珊蟛『Φ男Ч?(楊震等 , 20xx)。其中脂肽類抑菌物質(zhì)由于具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、抑菌活性高、抑菌譜廣等優(yōu)點而成為研究開發(fā)的熱點。 呂應年等 , 20xx。這就使得越來越多的國內(nèi)外學者把目光投向了天然防腐劑的開發(fā)利用，而微生物因具有生長繁殖快、生長條件簡單、易于分離培養(yǎng)等優(yōu)點已成為天然防腐劑研究開發(fā)的熱點。在無菌條件下，用無菌水對樣品懸液進行梯度稀釋，得到 101~108 濃度的稀釋液。每個處理重復 3次， 28℃ 恒溫培養(yǎng) 5d，定期查看病原真菌的生長情況，測量并記錄抑菌帶寬。 拮抗菌株生理生化特性分析 參照《常見細菌系 統(tǒng)鑒定手冊》 (東秀珠和蔡妙英， 20xx)進行拮抗菌株的生理生化試驗，包括需氧性、運動性、生長溫度、葡萄糖發(fā)酵試驗、過氧化氫酶試驗、 VP 試驗、淀粉水解試驗、檸檬酸鹽利用試驗、酪蛋白水解試驗、硝酸鹽還原試驗、耐鹽性試驗、纖維素降解試驗、明膠液化試驗、尿素利用試驗、吲哚試驗、 營養(yǎng)肉湯生長試驗等。 系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序結(jié)果與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中已有的 16S rDNA 序列進行 BLAST比對，并利用軟件 MEGA 構(gòu)建 NeighborJoining系統(tǒng)發(fā)育樹。綜合比較初篩及復篩結(jié)果可知，菌株LM2303 廣譜拮抗效果最好，故選取菌株 LM2303 進行后續(xù)研究。 177。 DT2101 5177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 表 28 拮抗菌株復篩結(jié)果 菌株 抑菌帶寬 /mm LM2303 177。 表 26 細菌菌株分離結(jié)果 樣品 菌株編號 菌株數(shù) LM07 LM0701LM0709 9 BH03 BH0301BH0311 11 BH04 BH0401BH0407 7 LM08 LM0801LM0805 5 LM19 LM1901LM1907 7 LM21 LM2101LM2108 8 LM23 LM2301LM2312 12 DT02 DT0201DT0204 4 DT05 DT0501DT0505 5 DT06 DT0601DT0606 6 DT18 DT1801DT1806 6 DT19 DT1901DT1909 9 DT21 DT2101DT2112 12 RST19 RST1901RST1910 10 SQ03 SQ0301SQ0305 5 DZ02 DZ0201DZ0208 8 DZ05 DZ0501DZ0509 9 DZ06 DZ0601DZ0609 9 ddH20 12μL 模板 1μL 引物 1 1μL 引物 2 1μL 2Taq Plus PCR Green Mix 15μL 總體系 30μL 廣譜