高中生物同步課件：53血紅蛋白的提取和分離5人教版選修1(完整版)
【正文】 分離血紅蛋白溶液： ① 過程： 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以 2020r/min的速度離心 10 min。 市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N’ 亞甲基雙丙烯酰胺在 引發(fā)劑 和 催化劑 的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。其中，能對抗外來強(qiáng)堿的稱為 共軛酸 ； 能對抗外來強(qiáng)酸的稱為 共軛堿 。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 血 紅 蛋白 血紅蛋白 兩個 α －肽鏈 兩個 β 一肽鏈 四個亞鐵 血 紅素基團(tuán) 每個肽鏈環(huán)繞一個 亞鐵血紅素基團(tuán)， 此基團(tuán)可攜帶 一分子氧或一分子二 氧化碳， 血紅蛋白因含有 血紅素 而 呈 紅色。 本課題學(xué)習(xí)目標(biāo) 體驗從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。 血紅蛋白的特點： ： 選用一定的 物理或化學(xué) 的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的 生物大分子 。③ 依據(jù)的特性是： 蛋白質(zhì)分子量的大小。 這一共軛酸堿通常稱為 緩沖對、緩沖劑或緩沖系 。 N,N’ 亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)） 丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N’ 亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的 遷移率 取決 于它所帶 凈電荷 的多少以及 分子的大小 等因素。 二、實驗操作 樣品處理 → 粗分離 → 純化 → 純度鑒定 ： （一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟 （二）操作過程 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎 動物的血液來分離血紅蛋白。 ②試管中溶液層次： 第 1層（最上層）：甲苯層（ 無色透明 ）；第 2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（ 白色薄層固體 ）；第 3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（ 紅色透明液體 ）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（ 暗紅色 ）。④組裝： 將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體 。 注意： 凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 ④洗脫： 小心加入 pH= 的 20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 開始進(jìn)行層析 收集得到的純化后的蛋白 思考下面的問題： 讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的 pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。 三、實驗結(jié)果分析與評價 你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？ 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 ③用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液。 由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。 （ 7）剝膠： 從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)， 例如藍(lán)色葡聚糖 — 2020或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。因此， 樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出 ，這種現(xiàn)象又叫 分子篩現(xiàn)象 。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們在某個特定的 pH下會帶上正電或負(fù)電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。 A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度 3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（ ）的電極移動。 A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動蛋白 D肌球蛋白 B B B A 5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ ）的含量最多。 血紅蛋白提取和分離的程序可分為 四大步 ，包括： 樣品處理 、 粗分離 、 純化 和 純度鑒定 。 在一定范圍內(nèi)，能對抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液 pH發(fā)生明顯變化的作用叫做 緩沖作用 ，具有緩沖作用的溶液叫做 緩沖溶液 。 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 （ 8）染色： 將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色 12 h。 （ 4） 濃縮膠聚合完全后（ 30 min），小心移出梳子。 在進(jìn)行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成。 ⑤用去離子水配制 10% 過硫酸銨： 作用是提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙 丙烯酰胺聚合所必需的自由基。如果色帶均勻、狹
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